西罗莫司血药浓度测定方法的建立及在肝移植患者中的应用

1、收稿日期 :20100817作者单位 :1. 大连医科大学附属第二医院药剂科 , 大连 116027; 2. 大连医科大学药学院 , 大连 116044*通讯作者西罗莫司血药浓度测定方法的建立及在肝移植患者中的应用张宁 1, 吕慧怡 1*, 邓卅 2, 范青1摘 要 目的 建立高效液相色谱法测定西罗莫司血药浓度 , 测定该药在肝移植患者中的药代动力学参数 。 方法 以沉淀 -萃取法处理全血样品 , 采用 Hypersil ODS C 18(250mm 4. 6mm , 5m 柱 , 柱温为 50 , 乙腈 -甲醇 -水 (7. 5 62. 5 30 为流动相 , 流速 1. 2mL /min

2、, 以 32-去甲基雷帕霉素为内标 , 在 276nm 波长处 , 检测西罗莫 司血药浓度 , 并应用此方法测定 5例肝移植患者的西罗莫司血药浓度 。 结果 全血中西罗莫司浓度在 2. 0 50. 0ng /mL 范围内线性良好 (r =0. 9997 , 平均相对回收率为 99. 1%(n =5 。 5例肝移植患者的 C max 为 (12. 664. 1 ng /mL , t 1/2为 (19. 2 11. 2 h , t max 为 (1. 8 0. 3 h 。 结论 本方法快速 、 简便 、 准确 , 灵敏度高 , 重现性好 , 可用于肝移植患者的西罗莫司临床药物监测 。关键词 西罗莫

3、司 ; 高效液相色谱法 ; 血药浓度 ; 肝移植Determination of sirolimus in human whole blood by HPLC and the exploratory in liver transplantation ZHANG Ning 1, L Hui-yi 1*, DENG Sa 2, FAN Qing 1(1. Department of Pharmacy ,The Second Affiliated Hospital of Dalian Medical University , Dalian 116027, China ; 2. Department

4、of Pharmacology , Dalian Medical University , Dalian 116044, China Abstract Objective To establish an HPLC method to determine the concentration of sirolimus in wholebloodMethodsThe whole-blood samples were pretreated by precipitation-extraction method , and sirolimus was de-termined by HPLC-UVHyper

5、sil ODS C 18analysis column (250mm 4. 6mm ,5m was used , and the temperature was set at 50 The mobile phase was a mixture of acetonitrile-methanol-water (7. 5 62. 5 30 with a flow rate of 1. 2mL /minThe detection wavelength was set at 276nmResultsThe calibration curve was linear within the range 2.

6、050ng /mL (r =0. 9997 . The mean relative recovery was 99. 1%, and the mean absolute recovery was 82. 2%(n =5 The intra-day and the inter-day relative standard deviation did not exceed 3. 3%and 6. 3%respectivelyIn the five transplantation receptors , C max was (12. 66 4. 1 ng /mL , t 1/2was (19. 2 1

7、1. 2 h , t max was (1. 8 0. 3 hConclusion This method is simple , rapid , sensitive and suitable for therapeutic drug monitoring of sirolimusKey words :Sirolimus ; HPLC ; Plasma drug concentration ; Liver transplantation西罗莫司 (Sirolimus , SRL , 商品名 Rapamune , 雷帕霉素 , 是一种大环内酯类免疫抑制剂 , 具有 抗增殖 、 抗肿瘤及无肾毒性等

8、特性 , 近年来逐渐应 用于肝移植患者 , 使临床获得了防治肝移植术后 肾功能不全 、 慢性排斥反应 、 肿瘤复发和提高移植物长期存活的新途径 1。 血药浓度监测对于保证 SRL 免疫抑制效果和临床安全性具有重要的意 义 。 本文采用高效液相色谱法测定西罗莫司血药 浓度 , 并分析此方法在肝移植患者中的合理应用 。 1实验材料1. 1仪器 日本岛津 HPLC 色谱仪 (LC-20AT 二元梯度泵 ,COM -20A 控制模块 , SPD-M20A 二极 管阵列检测器 ,QT-330型色谱柱恒温箱 (大连三 杰科 技 发 展 有 限 公 司 ,wi2568529电 动 离 心 机 (东仪科技有限

9、公司 , AS701KDT 型超声波清洗器 (北京鸿泰顺达科技有限公司 , XY-22型浓缩 氮吹仪 (青岛新益通有限公司 , YKH- 型液体 快速混旋器 (江西医疗器械厂 ,AW-120型分析天 平 (日本岛津 。1. 2药 品 与 试 剂 西 罗 莫 司 对 照 品 (纯 度 为 98. 0%, 天津新美科技有限公司 , 32-去甲基雷帕 霉素 (纯度为 98. 0%, 天津新美科技有限公司 , 甲 醇 (色谱纯 , 天津康巢正兴科技发展有限公司 , 氢 氧化钠 (分析纯 , 上海慈太龙实业有限公司 , 乙腈 (色谱纯 , 天津市康巢科技开发有限公司 , 硫酸锌 (分析纯 , 上海光铧科

10、技有限公司 , 1-氯正丁烷 ( 99. 5, 广州伟伯化工有限公司 。 2实验方法与结果2. 1色 谱 条 件 色 谱 柱 :Hypersil ODS C 18柱 (250mm 4. 6mm , 5m , 大连伊利特分析仪器 有限公司 ; 流动相 :乙腈 -甲醇 -水 (7. 5 62. 5 30 ;流速 :1. 2mL /min; 紫外检测波长 :276nm ; 进样 量 :20L ; 柱温 :50 ; 内标物 :32-去甲基雷帕霉素 。 在上述色谱条件下 , 全血中内源性杂质不影 响西罗莫司与内标的分离测定 , 西罗莫司与内标的保留时间分别为 16. 3、 26. 8min , 空白全血

11、 、 对照品及全血样品色谱图 , 如图 1。 2. 2标准溶液配制2. 2. 1西罗莫司对照品溶液配制 精密称取西罗莫司标准品 1mg ,置于 10mL 的容量瓶中 , 以甲 ·82·实用药物与临床 2011年第 14卷第 1期 Practical Pharmacy And Clinical Remedies , 2011, Vol14, No1醇溶解并定容 , 制得浓度为 100g /mL的西罗莫 司标准溶液 , 备用 。图 1西罗莫司的高效液相色谱图注 :A. 空白全血 ; B. 对照品 ; C. 全血样品 ; -SRL , -内标2. 2. 2内标溶液配制 精密称取

12、32-去甲基雷帕霉素 0. 5mg , 置于 10mL 容量瓶中 , 以甲醇溶解并 定容 , 制成浓度为 50g /mL的内标液 。 精密量取 内标液 1mL , 置于 100mL 的容量瓶中 , 以甲醇溶解并稀释至刻度 , 摇匀制得 500ng /mL的内标标 准溶液 , 备用 。2. 3样 品 的 处 理 精 密 量 取 全 血 1. 0mL , 置 10mL 具塞离心试管中 , 加入 500ng /mL的内标溶 液 20L , 旋 涡 混 合 30s 后 , 加 入 蛋 白 沉 淀 剂 (甲醇 25%ZnSO 4=70 30 2. 0mL , 旋 涡 混 合 30s , 4500r /m

13、in离 心 10min , 取 上 清 液 加 入 0. 1mol /LNaOH 溶 液 400L , 混 匀 15s , 加 入 1. 0mL 1-氯正丁烷 , 水平振荡 10min , 4500r /min离心 10min 。 分离有机层 , 下层水相加入 1. 0mL的 1-氯正丁烷重复提取 1次 , 合并有机层以 N 2流 吹干 。 残渣加入甲醇 50L 旋涡混合 30s 。 取 20L 进样 , 记录色谱图 , 以 SRL 峰面积 (Ai 与内 标峰面积 (As 之比 Y 代入标准曲线 , 计算 SRL 全 血浓度 。2. 4标准曲线 分别精密吸取不同体积的西罗 莫司标准溶液 , 置

14、于 10mL 具塞离心管中 , 加入精 密量取的空白全血 1. 0mL , 混匀 , 使其浓度分别为 2. 0、 4. 0、 8. 0、 15. 0、 30. 0、 50. 0ng /mL。 按 “ 2. 3” 操 作 , 以不同浓度西罗莫司系列溶液的 Ai /As来计 算 Y (Y =Ai /As , 以 Y 值为纵坐标 、 西罗莫司浓 度 C 为 横 坐 标 进 行 线 性 回 归 。 在 2. 0 50. 0ng /mL浓度范围内 , 血药浓度与峰面积比有 良好线性关系 , 其回归方程为 :Y =0. 1195C +0. 0548(r =0. 9997 。2. 5回收率及精密度 分别在

15、1. 0mL 空白全血 中加入低 、 中 、 高 3种浓度的西罗莫司溶液 40L ,混匀 , 使其浓度分别为 4. 0、 15. 0、 50. 0ng /mL, 按“ 2. 3” 方法操作 , 将 SRL 峰面积与内标峰面积之 比 Y 代入标准曲线 , 计算 SRL 全血浓度 , 以测得 值 与 加 入 值 之 比 计 算 相 对 回 收 率 , 分 别 为101. 0%、 94. 3%和 101. 9%(n =5 。 另以 1. 0mL 空白全血不加药品 , 按 “ 2. 3” 操作 , 待萃取完毕后 ,在有机层中加入 50%甲醇配制成的相应浓度的 SRL 溶液 1. 0mL 及内标标准溶液

16、 20L , 继续按 “ 2. 3” 操作 , 以此为标准 , 将测定相对回收率所得 浓度值与此方法所测得浓度值相比 ,计算 SRL 绝 对回收 率 分 别 为 85. 4%、81. 9%和 79. 4%(n =5 。 按照测定相对回收率方法计算 SRL 全血浓度 ,以 1d 内 5次测得的 SRL 浓度计算日内精密 度 , 分别为 3. 3%、 1. 1%、 3. 1%, 以 1周内 5次测 定的 SRL 浓度计算日间精密度 , 分别为 6. 3%、 1. 4%、 5. 4%。 日内 、 日间 RSD 均小于 10%, 表明 该方法精密度良好 。 3临床应用肝移植术后患者 5例 , 男 3例

17、 , 女 2例 , 平均年 龄 (40. 2 11. 5 岁 。 移植术后初期均采用以他克莫司为主的抗排斥治疗方案 ,其中 2例患者术后 1个月内肾功能减退 , 怀疑因药物副作用引起 2, 另 外 3例于术后 6个月出现不能耐受的药物不良反 应 , 如高血糖 、 肌肉酸痛等 , 换以西罗莫司为主的抗排斥治疗方案 3。 在服用西罗莫司片达到稳态 后 , 在一次给药间隔口服西罗莫司 2mg 后 , 于 0、 0. 5、 1. 0、 1. 5、 2. 0、 3. 0、 4. 0、 6. 0、 8. 0、 12. 0、 16. 0、 24. 0h 测定西罗莫司全血浓度 (药 -时曲线如图 2 。 应用

18、 DAS 2. 0版 , 药物代谢动力学分析结果显示 , 西罗 莫 司 C max 为 (12. 66 4. 1 ng /mL, t 1/2为 (19. 2 11. 2 h , t max 为 (1. 8 0. 3 h 。 在 5例肝移 植患者使用过程中 ,出现总胆固醇升高 2例 , 服用 瑞舒伐他汀片 (10mg ,1次 /d口服 1个月后总胆 固醇均降至正常范围内 , 其他均未出现异常 。4讨论由于测定西罗莫司血药浓度时需用全血 , 而 全血中的血细胞及蛋白质分子 , 会使萃取时发生 乳化现象 , 对色谱柱分离产生较大的影响 , 因此 , 当西罗莫司从血细胞及血浆蛋白中提取至溶剂·

19、;92·实用药物与临床 2011年第 14卷第 1期 Practical Pharmacy And Clinical Remedies , 2011, Vol14, No1时 , 需加入蛋白沉淀试剂 , 沉淀 、 离心 , 从而消除细胞及蛋白干扰 。 而液 -液萃取法是被测组分从生物基质中分离 、纯化的常用方法 , 它可将被测组分自 大量内源性物质中选择性地萃取分离 。 本实验以 1-氯正丁烷为萃取液 , 有选择地将西罗莫司从混合 液中萃取出来 , 然后将上层有机层 (1-氯正丁烷 分离 , 再将萃取液挥发 , 最后得到浓集的被测组 分 。 此方法简便 , 色谱分离效果较好 , 主峰

20、易于识 别 , 缺点在于提取物质杂质较多 、 回收率低 , 影响 了其在 HPLC 中的应用 。图 2口服西罗莫司 2mg 后药 -时曲线国内的研究表明 ,SRL 治疗窗在稳态谷浓度 4 8ng /mL范围内 4-5, 而不是国外推荐应用的 10 15ng /mL。 在这个范围内 , 既能有效预防移 植肝发生急性排斥反应 , 又能减少其毒副作用 。 HPLC 法测定西罗莫司的线性范围为 2. 0 50ng /mL , 覆盖 SRL 有效浓度范围 , 但临床监测中发现 个别血药浓度 2. 0ng /mL, 超出本实验的线性范 围 , 给临床调整给药剂量造成一些不便 。参考文献 :1李冠军 , 董

21、桂青 , 金仲品 西罗莫司的研究进展 J 中国医 疗前沿 ,2008, 3(2 :34-362马秋野 , 孙峰 , 武步强 , 等 肝移植术后他克莫司血药浓度与尿 1微球蛋白及微量白蛋白的相关性研究 J 中国普外基础与临床杂志 ,2006, 13(3 :334-3353Watson CJ , Gimson AE , Alexander GJ , et alA randomizedcontrolled trial of late conversion from calcineurin inhibitor (CNI -based to sirolimus-based immunosuppressi

22、on in livertransplant recipients with impaired renal function J LiverTranspl ,2007, 13:1694-17024张晓军 , 傅志仁 西罗莫司在肝移植中的临床应用 J 肝胆 胰外科杂志 ,2010, 22(1 :83-85收稿日期 :20100902作者单位 :1. 中国医科大学第一附属医院药学部 , 沈阳 110001; 2. 济南三源药业有限公司 , 济南 250014; 3. 沈阳药科大学药学院 , 沈 阳 110016*通讯作者联苯苄唑乳膏体外经皮透过评价试验郜琪臻 1, 刘慧 2, 赵亚囡 3, 丁平田3

23、*摘 要 目的通过离体透过性试验 , 评估受试联苯苄唑乳膏透过安全性的大小 。 方法 以小型猪全皮皮肤为模型 ,应用改良的 Franz 立式扩散池 , 分别采用生理盐水 、 PEG400 生理盐水 (1 2 混合液为接受液 , 于 1、 2、 3、 4、 6、 8、 10h 定时取样 , 利用 HPLC 测定药物浓度 。 结果 对照联苯苄唑乳膏样品和受试样品在生理盐水接受液的条件下 ,均不能透过离体的小型猪皮肤 。 在 PEG400 生理盐水 (1 2 接收液条件下 , 有微量透过 , 10h 的累 积透过量受试联苯苄唑乳膏为 (0. 286 0. 100 g /cm 2, 对照联苯苄唑乳膏为

24、 (0. 269 0. 033 g /cm 2, 二者经皮 透过曲线基本一致 。 结论受试联苯苄唑乳膏和对照联苯苄唑乳膏在药物透过安全性大小上具有一致性 。关键词 联苯苄唑乳膏 ; 体外 ; 透皮吸收Study on percutaneous permeability of bifonazole creamsGAO Qi-zhen 1, LIU Hui 2, ZHAOYa-nan 3,DING Ping-tian 3*(1. Department of Pharmacy , The First Hospital of China Medical University , Shenyang 11

25、0001, China ; 2. Jinan Sanyuan Pharmaceutical Company , Jinan 250014, China ; 3. Shenyang Pharmaceutical Universi-ty ,Shenyang 110016, China Abstract Objective To evaluate the percutaneous permeability of bifonazole creams with miniature pig (thepama fragrant pig full thickness skin as the model in modified franz diffusion cellsMethods Physiological saline so-lution and the PEG400 physiological saline solution (1 2 was used as receptor mediumThe drug concentration in sam-ples withdrawn at 1,2, 3, 4, 6, 8, 10h was determined by HPLCResults Drug in the commercial product an