sp法与maxvision法免疫组织化学染色的对比观察

1、sp法与maxvision法免疫组织化学染色的对比观察【关键词】 免疫组织化学；二步法；max vision三步法；生物素免疫组织化学技术在我国开展已有二十多年，随着这项技术的不断改进和完善，已被病理学工作者广泛应用，目前已成为病理学科的常规行业技术，为病理诊断提供可靠的诊断依据。免疫组化染色方法有多种，如sp法、abc法、pap法、sabc法、二步法等，我们对常用的sp三步法和maxvision二步法进行比较，探讨其特异性和敏感性，为免疫组化染色提供更好的选择方法。1 材料与方法1.1 试验材料 取自本科常见肿瘤活检标本，包括乳腺癌、胃癌、神经纤维肉瘤、淋巴瘤、肾母细胞瘤。组织经10%中性福

2、尔马林固定，石蜡包埋，切片，60烘烤1 h。1.2 试剂 所用的抗体有细胞角蛋白（ck）、癌胚抗原（cea）、上皮细胞膜抗原（ema）、细胞增殖标记（ki67）、波形蛋白（vim）、结蛋白（desmin）、p53、s100蛋白（s100）、平滑肌动蛋白（actin）、cd68、cd34、cd45ro、神经元特异性烯醇化酶（nse）、神经胶质纤维酸性蛋白（gfap）、神经丝蛋白（nf）、白细胞共同抗原（lca）、cd3、cd20、cd79a、雌激素受体（er）、孕激素受体（pr）、癌基因（cerbb2）、凋亡抑制基因（bcl2）等20多种单克隆和多克隆抗体。maxvision法和sp法试剂盒均为

3、福建迈新公司产品。1.3 方法1.3.1 sp法：石蜡切片脱蜡至水后，3%h2o2抑制内源性过氧化物酶15 min,pbs洗3次3 min；根据一抗要求，对组织抗原进行相应的修复（柠檬酸缓冲液9510010 min或胰蛋白酶消化10 min），pbs洗3次3 min；非免疫动物血清封闭15 min；特异性一抗（阴性对照用pbs代替一抗）室温1 h或4过夜，pbs洗3次3 min；生物素标记二抗室温15 min, pbs洗3次3 min；过氧化物酶（hrp）标记链霉卵白素室温15 min, pbs洗3次3 min；dab显色3 min；流水洗，苏木素复染，脱水、透明、中性树胶封片。1.3.2 m

4、axvision法：前2步同上；特异性一抗（阴性对照用pbs代替一抗）室温1 h或40过夜，pbs洗3次3 min；多聚酶标二抗室温15 min, pbs洗3次3 min；dab显色3 min；流水洗，苏木素复染，脱水、透明、中性树胶封片。2 结果 神经纤维肉瘤和淋巴瘤组织，sp法和maxvision法两种方法免疫组化染色，特异性强，阳性定位准确，分别为细胞核、细胞膜和细胞浆呈棕色的阳性反应，经苏木素复染后，棕色与蓝色对比鲜明，背景清晰，无明显非特异性染色（图1、2）。乳腺癌、胃癌、肾母细胞瘤组织，两种免疫组化染色，maxvision法特异性和敏感性均高于sp法，maxvision法阴性对照片

5、，组织染色为阴性（图3），阳性片染色背景清晰，非特异性染色少，阳性部位突出、鲜明（图4）。sp法阴性对照片，大部分腺体、上皮胞浆出现内源性生物素假阳性染色（图5），阳性片中，抗体表达阳性的部位，由于内源性生物素假阳性干扰，使真正的阳性结果难以准确判断（图6）。3 讨论 免疫组织化学技术是利用已知的特异性抗体与抗原的特异性结合来鉴定组织或细胞内某种物质的性质，并利用酶作用于底物所产生的颜色反应来显示的一种技术。目前应用最广、染色结果最理想的是sp三步法和maxvision二步法。 人体细胞内存在生物素，以肝、肾、乳腺和脂肪内含量较高，但在人体的皮肤、淋巴结和脾脏冷冻组织中未检测到生物素1。生物素

6、广泛存在于上皮源性组织，特别是腺上皮组织，包括正常组织和肿瘤组织，亦存在部分非上皮组织2。 maxvision法是利用葡聚糖多聚体复合物技术，将抗鼠和（或）抗兔igg分子与过氧化物酶结合在葡萄糖聚合物上形成多聚物分子，替代传统方法中的二抗和三抗，直接放大抗原抗体信号。这种多聚物igg具有对一抗很强的亲和性，而过氧化物酶分子又使其具有很高的灵敏度。由于不使用生物素和链霉卵白素，从而避免了内源性生物素引起的非特异性背景染色，使二步法具有假阳性率低和背景清晰的特点3 。本试验结果也显示，背景染色干净，无非特异性染色，阳性产物明显突出，结果易于判断。特别适合于内源性生物素含量高的组织进行染色4。 sp

7、法是利用过氧化物酶标记的链霉卵白素与二抗标记的生物素之间的亲和反应形成复合物，催化底物dab着色，以检测靶抗原。如果待检组织和细胞中富含内源性生物素，可与氧化物酶标记的链霉卵白素结合，出现假阳性5。本试验结果显示，乳腺、胃、肾组织这些富含内源性生物素的组织2，由于内源性生物素的干扰，抗体表达为胞膜和胞浆阳性，如ck、cea、cerbb2、bcl2等抗体，免疫组化阳性结果较难判断。有研究者根据生物素与卵白素可发生化学亲和反应的原理，在加一抗之前利用卵白素预先封闭内源性生物素，得到了满意的结果6。但cooper等7利用该方法检测妊娠期子宫内膜的单纯疱疹病毒时发现，用卵白素孵育切片亦不能完全消除内源

8、性生物素导致的假阳性。 通过采用两种免疫组化方法对乳腺癌、胃癌、神经纤维肉瘤、淋巴瘤、肾母细胞瘤表达产物的检测，可以看出，对富含内源性生物素的组织，两种免疫组化方法，从敏感性和特异性来说，maxvision二步法明显优于sp三步法，且maxvision法减少了两个操作步骤，无需血清封闭，比sp法省时4060 min。所以，maxvision二步法既适合富含内源性生物素组织的免疫组化病理诊断，又适合快速临床病理诊断，是一种理想的免疫组化染色方法。【参考文献】 1 wood gs，wanke r.suppression of endogenous avidinbinding activity in

9、 tissue and its relevance to biotinavidin detection systems. j histochemistry and cytochemistry, 1981,29:11961204.2 周小鸽. 免疫组织化学染色的干扰因素及处理. 临床与实验病理学杂志，2006，22:389.3 sabattini e, bisgaard k, ascani s,et al. the envision system: a new immunnohistochemical method for diagnostics and research critical co

10、mparison with the apaap, chemmate, csa, labc and sabc techniques. j clin pathol, 1998,51:506511.4 刘丽梅，柳凤轩.envision system 在免疫组织化学方法中应用的体会.第三军医大学学报，2001，23:491492.5 lezzoni jc, mills se,pelkey tj,et al. inhibin is not an immunohistochemical marker for hepatocellular carcinoma. an example of the poten

11、tial pitfall in diagnostic immunohistochemistry caused by endogenous. am j clin pathol, 1999,111:229234.6 wang h, pevsner j. detection of endogenous biotin in various tissues: novel functions in the hippocampus and implications for itsuse in avidinbiotin technologh. cell tissue res，1999,296:511516.7 cooper k, haffajee z,taylo