乙型肝炎核心抗体放射免疫定量试剂盒的研制

1、收稿日期:2003212223;修回日期:2004206210作者简介:官国英(1969,女(汉族,四川威远人,高级工程师,放射化学专业第17卷第3期2004年8月同位素Jou rnal of Iso topesV o l.17N o .3A ug .2004乙型肝炎核心抗体放射免疫定量试剂盒的研制官国英,孔繁信,王衍真,刘一兵,隗秀芳,王云艳(中国原子能科学研究院同位素研究所,北京102413摘要:以聚苯乙烯小球为固相载体,在小球表面包被一层基因工程制备的乙型肝炎核心抗原(HBc A g ,以125I 标记的乙型肝炎核心抗体(125I 2A n ti 2HBc 作为标记物,采用固相放射免疫竞

2、争法研制成乙型肝炎核心抗体放射免疫定量试剂盒(A n ti 2HBc 2R I A 。本试剂盒的灵敏度为0.8N CU mL ,批内变异系数<9.9%,批间变异系数<13.8%,回收率为92.6%109.2%。正常参考值为02.0N CU mL 。关键词:乙型肝炎病毒(HBV ;乙型肝炎核心抗体(A n ti 2HBc ;固相放射免疫分析中图分类号:TQ 46317;Q 615142文献标识码:A 文章编号:100027512(20040320143204病毒性肝炎是世界性重点研究课题之一,至今尚无特效治疗措施。我国现有肝炎病人2700万,每年新发病例900万,乙型肝炎病毒携带者1

3、12亿1,已严重影响了人们身体健康和正常生活,故对病毒性肝炎进行早诊断,早治疗,切断传染源和传播途径有重要的社会经济意义。乙型肝炎核心抗体(A n ti 2HB c 是针对乙型肝炎核心抗原(HB c A g 的抗体,不具有保护性,但却是乙型肝炎感染的可靠指标,分为A n ti 2HB c 2IgG 和A n ti 2HB c 2Ig M ,前者低滴度时作为既往感染的指标,用于乙型肝炎流行病学的调查,高滴度时作为乙型肝炎感染的指标;后者出现于新感染早期,是乙型肝炎早期诊断的指标,同时也是乙型肝炎急性感染和复制活跃的指针2。定量测定乙型肝炎核心抗体含量,对于乙型肝炎的临床诊断、治疗效果评价、严格筛

4、选供血血源、阻断乙型肝炎的传播等有一定的参考价值。1材料与方法111试剂与仪器HB c A g :中美合资延春益康科学研究所产品;A n ti 2HB c 血清:中国预防医学科学院病毒所生物免疫制品室产品;A n ti 2HB c 参考标准:中国药品生物制品检定所产品;新生牛血清:北京军区兽医防治中心产品;聚苯乙烯小球:北京门头沟淤白塑料厂产品;125I 2N a I 溶液:放化纯度99.9%,中国原子能科学研究院产品;FT 2630G微机多探头计数器:北京核仪器厂产品。112实验方法1.2.1125I 2A n ti 2HB c 的制备采用氯胺T (Ch 2T 法3,标记率70%,放化纯度&

5、gt;90%,将原溶液稀释到一定的放射性浓度作为工作液,分装,冻干,4贮存备用。1.2.2HB c A g 包被小球的制备将预先处理好的塑料小球倒入含HB c A g 0.02m o l L pH 7.4的磷酸盐缓冲液(PB S 中,4过夜,封闭,分装,4贮存备用。1.2.3A n ti 2HB c 标准品的制备将A n ti 2HB c 母液标定后进行倍比稀释,配制浓度依次为0、2、8、16、32、64、128N CU mL 系列标准品,分装,4贮存备用。1.2.4A n ti 2HB c 放射免疫分析程序将放免管或反应盘编号,取100L 标准品或样品和100L 125I 2A n ti 2

6、HB c ,加入相应的管(孔中,各加入1粒HB c A g 包被小球,混匀,45水浴中温育1.5h。吸出液相,用23mL蒸馏水洗涤3次,将小球转入干净试管中测量放射性计数率(m in-1,绘制标准曲线,计算样品中A n ti2HB c 的含量。2结果与分析211HBcAg包被条件的选择2.1.1HB c A g包被滴度的选择取HB c A g母液用0.02m o l L pH7.4PB S按11000、12000、13000、14000、16000稀释成系列工作液,包被预先处理好的塑料小球,4过夜。按11214进行实验,结果列于表1。由表1可见,包被滴度为13000时,标准品含量为2N CU

7、mL的计数率与不含标准品时的计数率之比小于0.5(国家卫生部阳性判定标准4,抑制曲线符合免疫分析要求。表1HBcAg包被滴度实验包被滴度不同标准品浓度(N CU mL的放射性计数率 m in-1 02641281100020971161591157697120001983494438945651300019692838482734914000193794818441212160001896646874292012.1.2HB c A g包被时间选择将在HB c A g包被液中的塑料小球分别于4放置8、16、24、48 h后,按11214进行实验,结果列于表2。由表2可见,4包被16h已能满足免

8、疫分析要求。表2HBcAg包被时间实验包被时间 h 不同标准品浓度(N CU mL的放射性计数率( m in02648149846568296 16193728132747 24193828155752 48194328219768212125I-An ti-HBc冻干品与液体标记物稳定性比较分别将125I2A n ti2HB c冻干品与液体标记物于4存放30天后,按11214进行放射免疫分析,结果列于表3。由表3可见,标记物的冻干品比液体稳定性好,故选标记物冻干品用于免疫分析。表3125I-An ti-HBc冻干品与液体稳定性比较标记物放置时间d不同标准品浓度(N CU mL的放射性计数率

9、m in-10264液体019984856879630173728032547冻干019482835575230183328269738213标准品稀释液的选择选用5种稀释液配制标准品,不同稀释液配制的标准品的放射免疫分析结果列于表4。对表4数据进行t检验,结果显示,5种稀释液配制的标准品的分析结果无显著差异,P>0.05。从经济、稳定性角度考虑,选用稀释液 。表4An ti-HBc-R I A标准品稀释液实验稀释液不同标准品浓度(N CU mL的放射性计数率 m in-10264 15275736064316036698368215289732066515000703264314275

10、6982628214An ti-HBc-R I A动力学实验2.4.1反应条件的影响A n ti2HB c2R I A反应管或盘中加入标准品、样品、标记物、包被小球后分别于室温(25温育3h,37温育2h,45温育1.5h,各种反应条件下的放射免疫分析结果列于表5。由表5可见,45温育1.5h,时间短,抑制曲线好,能更好地满足免疫分析要求。441同位素第17卷表5An ti -HBc -R I A 反应条件实验温度温育时间 h不同标准品浓度(N CU mL 的放射性计数率 m in -10264室温3125835209560372146046721680451.51865479067332.4

11、.245下反应时间的影响A n ti 2HB c 2R I A 反应管或盘中加入标准品、样品、标记物、包被小球后于45温育不同时间,结果列于表6。由表6可见,45温育1.5h 已达平衡,故选择45温育1.5h 。表6An ti -HBc -R I A 温育时间实验(45反应时间 h不同标准品浓度(N CU mL 的放射性计数率 m in -12640.51304354076271.01460465686871.51721576097192.01722876327263.0172307658753215方法学鉴定2.5.1标准曲线和灵敏度A n ti 2HB c 2R I A 标准曲线示于图1。

12、采用20个0标准平均值x-2s 计算出本试剂盒的分析灵敏度为0.8N CUmL 。2.5.2精密度重复测定低、中、高3份A n ti 2HB c 血清样品,观察批内批间变异,结果列于表7。由表7可见,本试剂盒批内变异<10%,批间变异<15%,精密度达到临床要求。表7An ti -HBc -R I A 批内批间变异实验样品批内(n =10x ±s N CU mL -1CV %批间(n =8x ±s N CU mL -1CV %14.2±0.32716411±0.399.5212.3±0. 987191119±1.119.3

13、324.5±2.439192518±3.5813.82.5.3准确性取3份不同浓度的A n ti 2HB c血清样品分别加入到已知浓度的A n ti 2HB c 标图1An ti -HBc -R I A 标准曲线准品中,测定A n ti 2HB c 回收率,结果列于表8。由表8可见,其回收率在90%110%,准确性符合临床要求。表8An ti -HBc -R I A 回收实验结果样品A nti 2HBc含量预期值 N CU mL -1A nti 2HBc含量测定值 N CU mL -1回收率 %14.13.892.6212.513.2105.632527.3109.22.5

14、.4正常参考值测定120份正常人血清样品,范围为02.0N CU mL ,均值1.2N CUmL 。2.5.5整体试剂盒的稳定性将整体试剂盒分别于4放置35天,37放置7天,进行放射免疫分析,结果列于表9。由表9可见,4放置35天和37放置7天计数率下降不明显,仍能满足免疫分析要求,试剂盒稳定性符合临床要求。2.5.6临床应用本试剂盒与本院生产的乙型肝炎核心抗体放免定性试剂盒同时测定48份临床血清样品,结果列于表10。由表10可见,两种试剂盒在检测血样的阴、阳性方面具有较好的一致性。但相对于定性药盒,定量药盒能更准确地反映患者HB c A g 的含量,方便医生及时进行治疗。541第3期官国英等

15、:乙型肝炎核心抗体放射免疫定量试剂盒的研制表9An ti-HBc-R I A稳定性实验温度 放置时间d不同标准品浓度(N CU mL的放射性计数率 m in-10264室温0198118430837 435153156928622 377173757470759表10两种试剂盒的比较试剂盒阴性样品例阳性样品例可疑样品例总计例本院定性试剂盒379248本试剂盒3990483结论本试剂盒从固相包被、标记物、标准品、反应条件、温育时间等方面作了一系列条件优化工作,建立了A n ti2HB c放射免疫定量分析试剂盒的制备方法,直观反映出血清中核心抗体的含量,为乙型肝炎的诊断、疗效评价、血液制品的筛选等

16、提供参考4。参考文献:1蔡锡麟,陈耀华,秦明秀.临床放射免疫学M.北京:原子能出版社,1994.212221.2宋清林.病毒性肝炎的防治M.北京:人民军医出版社,1988.1013.3严杰,罗海波,陆德源,等.现代微生物学实验技术及其应用M.北京:人民卫生出版社,1997.187 188.4卫生部药品生物制品鉴定所.甲、乙型肝炎诊断试剂检定要求M.北京:卫生部药品生物制品鉴定所,1990112.5郑怀竟.抗2HBc(总检验中存在的问题与改进的方法J.中华医学检验杂志,1992,15:80.The Establ ishm en t of Sol id Pha se Rad io i m m un

17、oa ssay forQuan tita tive D eterm i na tion of Hepa titis B Core An tibodyGU AN Guo2ying,KON G Fan2x in,W AN G Yan2zhen,L I U Y i2b ing,W E I X iu2fang,W AN G Yun2yan(D ep a rt m en t of Isotop e,Ch ina Institu te of A to m ic E nergy,B eij ing102413,Ch inaAbstract:A sen sitive and sp ecific so lid

18、p hase radi o i m m unoassay fo r hep atitis B co re an tibody(an ti2 HB c2R I Ais estab lished.H ep atitis B co re an tigen(HB c A gis coated on the so lid p hase beads,125I2 an ti2HB c is u sed as the radi oactive tracer.T he sen sitivity of the assay is0.8N CU mL.T he in tra2 assay CV s and the in tre2assay CV s of3sam p les are9.9%and13.8%resp ectively.T he analytical recoveries are ranged from92.6%to109.2%.T he level of120no rm al sub jects is1.2N CU mL w ith a rang of02.0N C