不同物种Sprn基因编码区生物信息学分析

1、不同物种SPRN基因编码区生物信息学分析葛旭升 李祥龙* 通讯作者：李祥龙，男，教授，博士，博士生导师，lixianglongcn作者简介：葛旭升，男，1985年12月29日，硕士研究生，分子数量遗传与动物育种邮箱：gexusheng1229，电话周荣艳 李兰会(河北农业大学动物科技学院，保定 071000)摘 要：对来自26个物种的70条SPRN CDS序列及其相应氨基酸序列进行了生物信息分析。结果表明：检测到的229个多态位点中，其中有26个单一变异位点，203个简约变异位点。一个高度保守的N -端信号序列，精氨酸丰富的基本区域含有多达6个XXRG（其中X是G，A

2、或S）重复，20个残基疏水区域具有较强的朊蛋白同源性。关键词：SPRN基因；朊蛋白；生物信息分析 Bioinformatics analysis of SPRN gene in different speciesGe Xusheng Li Xianglong Zhou Rongyan Li Lanhui（College of Animal Science and Technology, Agricultural University of Hebei; Baoding 071000, China）Abstract: A total of 70 SPRN gene sequences with

3、the complete coding regions (CDS) and corresponding amino acid sequences belonging to 26 species were analyzed by using the software of BioEdit7.0.5 and DanSP 4.0 in order to study its genetic diversity. The results indicated that there were 229 variable sites including 26 singleton variable sites a

4、nd 203 parsimony informative sites. A highly conserved N-terminal signal sequence, Arg-rich basic region containing up to six tetra repeats of consensus XXRG (where X is G, A or S), and a hydrophobic region of 20 residues with strong homology to PrP were found.Key words：SPRN; PrP; Bioinformatics在过去十

5、年中，对朊病毒的研究已经扩展至人类和家畜都等许多物种1。朊病毒疾病是传染性的哺乳动物神经退化性疾病，包括羊瘙痒病，疯牛病和人的克雅氏病 2。SPRN是一种新的编码Shadoo的朊病毒样基因，是一个重要的类朊蛋白编码基因。SPRN最初在斑马鱼研究中发现1，而目前SPRN已经发现存在于所有脊椎动物中4, SPRN基因被认为是在朊病毒的发病过程一个重要的候选基因1,2。在人类中，已经发现了SPRN的突变及其突变频率与人的克雅氏存在联系。然而，在马、羊研究中，SPRN突变的影响尚不清楚3。通过对不同种属旁系同源基因的分析比较研究，阐明了朊病毒生理作用，其可能对朊蛋白编码蛋白质的朊病毒疾病有关1。SPR

6、N具有典型的两个外显子朊病毒的排列，CDS完全包含在外显子2中，此外，它有74.8可能编码143-氨基酸蛋白和84.7与人类的朊病毒编码相似1。本研究选用GenBank中已提交物种的SPRN基因的编码区序列，利用比较基因组学和生物信息学方法研究了该基因编码区的变异，以期探明该基因在不同种间及种内遗传分化，进而为动物育种工作提供基础资料。1. 材料和方法1.1 序列来源 从NCBI网站/的GenBank中下载26个物种的70条SPRN基因序列（表1）。表1 不同物种的SPRN基因序列来源Table 1 The source of sequenc

7、es for SPRN gene in different species物种Species序列数(Sample size)LengthStop codonGenbank Accession(基因库序列接受号)Capra hircus(山羊)3441TAGEU939682,EU559166,EU559165Ovis aries（绵羊）18441,438, 432,420, 435TAGEU380590,EU380591,EU38592,EU595763,EU595764,EU595765,EU595766,EU595767,EU595768,EU595769,GQ174495,GQ174496

8、,GQ174497,GQ174498,GQ174499,GQ174500, DQ870545,NM001162561Orvx （羚羊）5432TAGEU596568,EU596569,EU596570,EU596571,EU596572Bos taurus（牛）5432TAGBN000839,DQ058606,DQ531936,BC148119,NM001080321Bos_grunniens（牦牛）2432TAGEU596573 ,EU605793Bos_gaurus（野牛）2432,420TAGEU605791,EU605794Cervus elaphus（麋鹿）3432TAGEU5965

9、67,EU605792,GQ149482Mouse（小鼠）4444TAGBN000519,BC056484,AJ621426,NM183147Human（人）3456TAGBN000518,BC040198,NM001012508Pan troglodytes（黑猩猩）3456TAGBN000837, XM_001146049,BN000846Dog（狗）1444TAGBN000838Oryctolagus cuniculus（家兔）1435TAGBN000843Monkey（猴）2444TAA/TAGBN001004,BN000842Apodemus sylvaticus（森林姬鼠）1444

10、TAGEU595770Norway rat(挪威鼠)2444TAGNM_001031845,BN000520Cavia porcellus(土拨鼠)1456TAGBN000844Zebrafish（斑马鱼）5399,398TGA/TAGAJ490525,NM_198981,BC162116,BC16481, BC162128Pimephales promelas（黑头软口鲦）1399TAABN001008Takifugu rubripes（红鳍东方鲀）1458TAGBN000531Oryzias latipes（青鱂）1464TAGBN001007Tetraodon nigroviridis（

11、绿斑河豚）1458TAGAJ717305Gasterosteus aculeatus（三刺鱼）1458TAGBN000845Gallus gallus（原鸡）1354TGABN000836Myotis lucifugus(小棕蝙蝠)1435TAGBN001003Xenopus tropicalis（热带爪蟾）1441TAABN000841Monodelphis domestica（灰色短尾负鼠1441TAGBN0008401.2 分析方法 先利用BioEdit 软件对70个不同序列的SPRN基因编码区进行比对分析，选取完整编码区序列进行比较，再利用 DanSP 5.0软件对其进行遗传多样性分析

12、，生成单倍型，并计算遗传距离。再利用MEGA4.0软件的UPGMA方法进行聚类分析，构建聚类图。2. 结果与分析2.1 不同物种SPRN基因核苷酸多样性2.1.1 多态位点 在所分析的共有片段为517bp的70条序列中，发现229个多态位点，百分率为44.29%，其中单一多态位点26个，百分率为5.03%；简约多态位点203个，百分率为39.26%。不同物种内的多态位点数也各不相同。2.1.2 单倍型及其多样性 根据序列比对，在70条SPRN基因序列中发现33种单倍型。核苷酸多样性（）和平均核苷酸差异数（K）分别为0.19423和75.35965，明显高于各物种内（表2），说明该基因物种间分化

13、显著。其中猴子的平均核苷酸差异数和核苷酸多样性最高，其次是羚羊的。单倍型数最高的是绵羊，其次是羚羊，表明羚羊的SPRN基因存在较丰富的遗传多样性。表2 不同物种SPRN基因的单倍型多样性Table 2 Haplotype diversity of SPRN gene in different species物种Species序列N单倍型数Np单倍型多样性Hd平均核苷酸差异数目K核苷酸多样性Capra hircus(山羊)320.666674.000000.01031Ovis aries（绵羊）1870.810461.254900.00323Orvx （羚羊）551.0000016.300000

14、.04201Bos taurus（牛）520.400000.400000.00103Bos_grunniens（牦牛）221.000003.000000.00773Bos_gaurus（野牛）221.000001.000000.00258Cervus elaphus（麋鹿）320.666671.333330.00344Mouse（小鼠）410.000000.000000.00000Norway rat(挪威鼠)210.000000.000000.00000Human（人）320.666670.666670.00172Monkey（猴）221.0000032.000000.08247Pan tr

15、oglodytes（黑猩猩）320.666678.666670.02234Zebrafish（斑马鱼）530.700007.200000.01856N, 序列数; Np, 单倍型数; Hd 单倍型多样性; K, 平均核苷酸差异数目; , 核苷酸多样性N, Number of sequences; Np, No. of haplotype; Hd, Haplotype diversity;K, average number of nucleotide differences; , Nucleotide diversity2.1.3 物种间核苷酸歧异度、净遗传距离和遗传分化 各种群间核苷酸歧异度(

16、Dxy) 在0.0060.603之间，净遗传距离在0.0020.592之间，遗传分化在0.0001.000之间(表3)，不同物种间核苷酸歧异度、净遗传距离和遗传分化的变化范围都很大，其中牛、牦牛和野牛，人和黑猩猩以及绵羊和山羊间的核苷酸歧异度、净遗传距离较小，说明牛、牦牛和野牛的亲缘关系较近，人与黑猩猩的亲缘关系较近，绵羊和山羊的亲缘关系都较近，其中斑马鱼与其它物种间的核苷酸歧异度和净遗传距离均最大。这说明斑马鱼与本研究中其他物种间亲缘关系较远，基本上与NCBI上的动物学分类相符合。根据不同物种之间遗传分化（Gst），用MEGA4.0 软件的UPGMA方法构建不同物种分子聚类图（图1）。根据聚

17、类图分析得出，牛、牦牛和野牛亲缘关系较近，人、黑猩猩和猴子的亲缘关系较近，山羊和绵羊的亲缘关系较近，斑马鱼与其他物种的亲缘关系最远，基本上与NCBI上的动物学分类相符合。表3 不同物种核苷酸歧异度、净遗传距离和遗传分化Table 3 Nucleotide divergence, net genetic distance and genetic differentiation of haplotype in different species物种山羊绵羊羚羊牛牦牛野牛麋鹿小鼠挪威鼠人猴子黑猩猩斑马鱼山羊0.0140.0260.0540.0500.0470.0770.2440.2620.1860.

18、1440.1780.568绵羊0.020(0.116)0.0230.0480.0460.0440.0770.2440.2620.1870.1460.1790.577羚羊0.052(0.089)0.045 (0.055)0.0210.0200.0190.0500.2380.2540.1750.1310.1670.560牛0.057(0.308)0.050(0.17)0.043(0.18)0.0020.0040.0660.2620.2830.1970.1540.1870.590牦牛0.059(0.098）0.052(0.099)0.045(0.031）0.006(0.148）0.0030.0640

19、.2600.2810.1930.1510.1830.582野牛0.054(0.098）0.047(0.099）0.041(0.031）,0.006(0.198）0.008(0.000）0.0620.2580.2780.1930.1500.1850.585麋鹿0.084(0.200)0.081(0.116)0.073(0.089)0.069(0.308)0.070(0.098)0.065(0.098)0.2530.2660.1910.1510.1810.592小鼠0.249(0.534)0.246(0.230)0.259(0.308)0.262（0.640)0.264(0.407)0.259(0

20、.407)0.254(0.534)0.0570.2060.1690.2500.589挪威鼠0.267(0.447)0.264(0.191)0.275(0.241)0.283(0.540)0.285(0.333)0.280(0.333)0.267(0.447)0.057(1.000)0.2240.1880.2220.586人0.192(0.200)0.190(0.116)0.197(0.089)0.199(0.308)0.198(0.0978)0.196(0.098)0.193(0.200）0.207(0.534）0.225(0.447）0.0180.0040.575猴0.190(0.098）0

21、.189(0.099）0.194(0.031）0.195(0.198）0.196(0.000）0.192(0.000）0.194(0.098）0.210(0.407）0.230(0.333）0.060(0.098）0.0130.532黑猩猩0.195(0.200）0.192(0.116）0.199(0.089）0.199(0.308）0.198(0.098）0.197(0.098）0.194(0.200）0.217(0.534）0.233(0.447）0.016(0.200）0.065(0.098）0.564斑马鱼0.583(0.183)0.587(0.112)0.590(0.081)0.60

22、0(0.290)0.598(0.099）0.595(0.099）0.603(0.183）0.599(0.453）0.595(0.360）0.5855(0.183）0.583(0.099）0.585(0.183）上三角为净遗传距离(Da)，下三角为核苷酸歧异度(Dxy)和遗传分化（Gst）（括号内）Above diagonal is net genetic distance(Da)；below diagonal is nucleotide divergence(Dxy) and genetic differentiation of haplotype（Gst）(in bracket)图1 根据物

23、种间的遗传分化构建的聚类图Figure.1 Phylogenetic tree based on genetic differentiation of species2.2 不同物种SPRN氨基酸多样性分析 不同物种70条 SPRN基因序列编码区中同义替换平均位点数为60.09个，非同义替换平均位点数为152.91个。不同物种同义替换位点数(SS)为51.1762.17(表4），同义替换核苷酸多样性均值(s)为0.36647。非同义替换位点数（NSS）为150.83157.40，非同义替换核苷酸多样性均值(a)为0.20448。绵羊的非同义替换位点数较其它物种多，说明绵羊SPRN基因编码区的非

24、同义替换较其它物种高。表4 不同物种SPRN基因同义替换和非同义替换Table 4 Synonymous and nonsynonymous substitution of SPRN gene in different speciesSpecies（物种）同义替换位点数(SS)非同义替换位点数(NSS)Capra hircus(山羊)60.72152.28Ovis aries（绵羊）60.34152.67Orvx （羚羊）51.17151.60Bos taurus（牛）60.33152.67Bos_grunniens（牦牛）60.17152.84Bos_gaurus（野牛）60.33152.6

25、7Cervus elaphus（麋鹿）60.56152.44Mouse（小鼠）61.67151.33Norway rat(挪威鼠)62.17150.83Human（人）60.33152.67Monkey（猴）60.92152.08Pan troglodytes（黑猩猩）60.83152.17Zebrafish（斑马鱼）55.60157.40SS, 同义替换位点数; NSS, 非同义替换位点数; SS, Synonymous sites; NSS, Nonsynonymous sites2.3 氨基酸序列结构功能域分析 SPRN的基因，编码Shadoo朊蛋白,它与蛋白质的同源性和朊蛋白的某些功能

26、有关5。对43条氨基酸序列结构分析，发现SPRN基因编码氨基酸序列中含有一个高度保守的N -端信号序列，精氨酸丰富的基本区域含有多达6个XXRG（其中X是G，A或S）重复，20个残基疏水区域具有较强的朊蛋白同源性，并含信号肽和跨膜结构域。以山羊氨基酸序列EU939682和斑马鱼氨基酸序列BC164818分别作为哺乳动物和非哺乳动物代表比对两大类动物间的结构差异（见图2），发现哺乳动物低复杂性区域明显多于非哺乳动物，这可能是因为变异蛋白在一定区域内更倾向于反复使用一种氨基酸，而原始蛋白的这种倾向较弱6。 图2 氨基酸序列EU939682结构功能域分析 氨基酸序列BC164818结构功能域 (注：

27、加粗部分表示低复杂性区域)3. 分析讨论研究结果表明，不同物种间的核苷酸歧异度、净遗传距离和单倍型间的遗传距离均较大，这说明不同物种间遗传分化已经十分明显。从不同物种的70条SPRN基因序列构建的聚类图中可看到山羊，绵羊，牛类，麋鹿和羚羊之间亲缘关系较近，与动物分类一致。我们可以发现鱼和哺乳动物的SPRN为同源基因，并有较高的保守区。但是，它们的DNA序列存在分歧，这表明四足动物和鱼的基因可能有显着不同的功能7。 本研究中发现，所选物种的SPRN基因的非同义替换位点数均明显高于同义替换位点数，说明所分析的这两个种群进化过程中可能受到正选择的影响8。物种间的SPRN基因有229个突变位点，这些突

28、变位点是否与不同物种动物的朊蛋白疾病发生有关还需要进一步研究，在某些物种内发现仅生成一种单倍型，除了由于SPRN基因编码区在物种内较保守的原因外，可能还与这些物种样本含量太小有关。参考文献：1 Uboldi C, Paulis M, Guidi E, et al, Cloning of the bovine prion-like Shadoo (SPRN) gene by comparative analysis of the predicted genomic locus J. Mammalian Genome, 2006; 17(11):1130-1139.2 Lloyd SE, Grizenkova J, Pota H, Collinge J, Shadoo (SPRN) and prion disease incubation time in mice. Mamm Genome J. Mammalian Genome, 2009;20(6): 367-