利用原生质体融合构建耐盐固氮菌

1、利用原生质体融合构建耐盐固氮菌张广志，杨合同1,23,李纪顺1,陈凯1(1.山东省科学院中日友好生物技术研究中心，山东省应用微生物重点实验室：山东济南250014;2.山东理工大学生命科学学院,山东淄博255049摘要：为提高多功能褐球固氮菌YKT41(Azotobacterchroococcum的耐盐碱能力，将耐盐菌微球菌(Micrococcussp.MNY2与该固氮菌进行原生质体融合。采用选择性及非选择性培养基对融合子进行12次传代试验后，获得稳定融合子15株，生物测定表明，融合子YM2和YM9表现出双亲的固氮、耐盐、抑菌等优良性状。关键词：固氮菌；耐盐菌；原生质体融合；抑真菌作用中图分类

2、号：S15413文献标识码：A文章编号：1673-6257(201002-0086-04收稿日期：2009-07-02;最后修订日期：2009-10-23基金项目：国家“86科划现代农业技术领域重大项目（2006AA10A211,山东省科技攻关重点项目（2005GG3209057,中国援助巴西项目（2009DFA32340。作者简介：张广志（1978-,男，山东临胸人,硕士研究生,研究方向为农业微生物资源与应用。通讯作者为杨合同。原生质体融合技术是20世纪60年代发展起来的基因重组技术，至今已成为基础分子生物学研究和微生物育种的一种有效方法，量大，不受亲缘关系的影响，以选育理想的融合株，段。也

3、得到广泛研究，1将具有高效固氮活性的根瘤菌和具有良好生防效果的枯草芽抱杆菌进行原生质体融合，获得同时具有高效固氮和生防效果的融合子。余荔华等人将枯草芽抱杆菌与克氏固氮菌（Klebsiellaoxytoca进行原生质体融合，融合子表现出双亲的耐热、抑菌、固氮等优良性状，具有潜在的应用价值20固氮菌是土壤生态系统中十分重要的功能菌之一,在土壤氮素循环中发挥着不可替代的作用30但多数固氮菌抗逆性弱，在自然环境中生存力差，这是使用菌剂达不到预期效果的主要问题之一2,4。本试验采用的褐球固氮菌（AzotobacterchroococcumYKT41是中白国际合作引进的一株多功能工程菌，具有明显地固氮、抗

4、病等活性，研制的微生物肥料用于田间或小区试验均取得明显地增产和抗病效果5,6,推广效果良好，但耐盐能力差，在盐碱土壤中应用效果不理想。本项目通过原生质体融合技术,YKT41按照功能,、耐盐和抗病等,并、安全性实验以及生物活性测定,获得固氮、耐盐等多种功能的菌株，以用于新型多功能微生物肥料的研究与开发。1材料与方法111菌种褐球固氮菌YKT41（Azotobacterchroococcum从白俄罗斯国家科学院遗传与细胞学研究所引进；耐盐菌MNY2为本实验室从东营盐化耕地土壤中分离，参照东秀珠和蔡妙英编著的常见细菌系统鉴定手册鉴定为微球菌属（Micrococcus,可而寸NaCl浓度在15%以上，

5、无氮培养基上不能生长7。112试剂SMMA缓冲液:015mol/L蔗糖,0102mol/L顺丁稀二酸,0102mol/LMgCl2?6H20,用NaOH调节至617,0107MPa灭菌20min。溶菌酶（Lysozyme，购自上海生工生物工程技术服务公司，以SMM缓冲液配制，过滤除菌备用。PEG溶液：40g聚乙二酸（6000溶于100mLSMM缓冲液。新生钙液：54%的KH2P04与2914%的CaCl2?H20灭菌后等体积混合80113A口斤分YKT41液体培养基：蔗糖20g;K2HP040164g;KH2P040116g;CaC03510g;MgS04?7H20012g;NaCl012g;

6、CaS04?2H20011g;琼月旨18g;蒸储水68一中国土壤与肥料2010(21000mL;pH712。MNY2液体培养基：柠檬酸钠310g;蛋白豚510g;酵母粉1010g;KCl210g;MgSO4?7H2O810g;NaCl4010g;琼月旨15g;蒸储水1000mL;pH710。选择性培养基:柠檬酸钠310g;K2HPO40164g;KH2PO40116g;CaCO3510g;MgSO?7H2O810g;NaCl4010g;KCl210g;CaSO4?2H2O011g;蔗糖20g;琼脂18g;蒸储水1000mL;pH710o高渗选择性培养基:选择性培养基+蔗糖015mol。114原

7、生质体制备与融合将新鲜斜面接入液体培养基中2628c培养过夜，再以5%接种量接入新鲜液体培养基中，振荡培养到对数期(108cfu/mL6000r/min离心15min,收集菌体，用SMM缓冲液洗涤两次。悬于冲液中，37c预热，YKT41和mg/mL的溶菌酶、SMM015mL,按1：1比例混合，3000r/min离心10min,沉淀物中加入019mL40%PEG6000和011mL新生钙液摇匀，置37C,水浴保温10min,离心沉淀，用SMM缓冲液稀释，并涂于高渗选择性培养基平板上，置2830C温箱培养3d,在此平板上生长的可初步断定为融合子。在此基础上转接于选择性培养基上进行稳定性试验，连续传

8、代10次以上，筛选出性状稳定的菌株。115融合子多功能活性测止11511固氮活性测定参照黄懿梅等人的全氮比色法计算微生物量氮9,依此推算供试菌株的固氮能力。11512耐盐能力测定配置液体培养基,将NaCl浓度设7个梯度,分别为0%、015%、1%、5%、10%、15%和20%,接入相同量的待测菌株悬浮液，2830C振荡培养2d,测定OD650值10o11513抑制病原真菌测定采用平板对峙法，用无菌打孔器分别将平板培养的立枯丝核菌（Rhizoctoniasolani、禾谷丝核菌（Rhizoctoniacerealis、灰霉葡萄抱菌（Botrytiscinerea病原真菌打成直径为5mm的菌片，将

9、菌片接入PDA平板的中央；距病原菌菌苔2cm的圆周上均匀选取3点同样打孔，并分别滴入0105mL的培养7d的发酵菌液，28C培养23d,观察各菌株的抑菌圈，并测量抑菌带宽度。11514盆栽耐盐碱试验盆栽试验于2008年8月上旬进行，土样取自东营近郊盐碱化的棉田（通过测定电导率计算盐分含量约为019%。试验时，每盆装土115kg,播种棉花10棵，均匀拌入10g菌剂（含菌调整为2X08cfu/g,载体为草炭土，每盆播种棉花10粒，浇水以不从盆底流出为准。每处理重复6次，温室随机摆放。出苗后，疏为每盆5棵,以后按常规操作进行管理。3040d后调查结果。11515致病性测定,分别以小麦5mm筛,装入塑

10、料盆中，15粒,每盆浇水量保持一致,每处理重复3次，温室随机摆放。以后按常规操作进行管理。待所有菌株均出苗后，疏为每盆10棵。将3个供试菌株的发酵液中菌体浓度调到108cfu/mL,用无菌注射器将悬浮液注射到苗茎基部,每苗015mL。保湿24h,3d后开始观察苗基部是否出现病斑11。2结果与分析根据固氮菌YKT41不耐盐，而耐盐菌MNY2无固氮能力，在无氮培养基上不能生长的特性，根据互补原则，对两菌株进行原生质体融合，通过高盐无氮选择性培养基分离筛选耐盐固氮融合子。结果表明，两菌株原生质体易于融合，连续传代12次后，共获得稳定融合子15株，将各融合子分别转接到各种功能性培养基上，挑选固氮、耐盐

11、、抑菌等多功能优良性状融合子2株，分别为YM2和YM9,分别进行生物活性测定，同时检测其有无潜在致病性。211固氮量测定结果将待测菌株接种到阿须贝无氮液体培养基中，常规培养5d后，利用全氮比色测定其生物固氮量。测定结果表明，融合子YM2和YM9固氮量分别为30411、28514mg/L,固氮能力分别比出发菌株YKT41(26112mg/L提高16142%、9126%。212耐盐能力将液体培养基中的NaCl浓度设7个梯度，接一78中国土壤与肥料2010(2入1mL待测菌株菌悬液,30c振荡培养24h,测OD值,结果如图1。从图中看出,原始菌株MNY2耐盐能力最强；而供试的2个融合子YM2和YM9

12、也具有较好的耐盐活性,在5%NaCl浓度条件下可正常生长,高于10%NaCl,生长有慢慢降低趋势；而固氮菌YKT41耐盐能力较弱，高于1%NaCl条件下，生长受到明显地抑制图1不同盐浓度对菌株生长的影响213抑制原真菌活性通过平板对峙培养测定，抑菌活性（表1菌抑菌效果最好表1供试菌株立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani禾谷丝核菌（Rhizoctoniacerealis灰霉葡萄抱菌（Botrytiscinerea抑菌带宽度（cm抑制率（抑菌带宽度（cm抑制率（%抑菌带宽度（cm抑制率（%YM20192a46100170a350145a2215YM90155b27150143b21150

13、140b20YKT410160b30100176c380118c9MNY20126c13100d00d0CK0d0d0d注：同一列数据后小写字母不同者表示在5%水平时差异显著，下同。214盐碱条件下对作物生长的影响盆栽试验结果表明，接种供试耐盐固氮菌株在盐化土壤中比接种YKT41增产效果明显（表2。接种原始菌株YKT41棉花鲜重增加7194%,株高增加10%,表明该菌株在此盐碱程度的土壤中能发挥一定的肥效,与Vijayan等人12的研究结果较一致。而在此盐碱条件下接种融合菌株YM2和YM9菌株,棉花植株鲜重和株高均增加20%以上。表明两个融合菌株具备了原始菌株YKT41的固氮性状和耐盐菌MNY

14、2的耐盐性状，在该盐碱条件下能正常发挥其固氮效果。表2融合菌株在盐碱条件下的盆栽肥效试验供试菌株鲜重（g鲜重增加（株高（cm株高增加（YM201670a26165101550a27137YM901650a22187101375b25126YKT4101570b719491250c10171MNY201550b319781450d2102CK01529b81283e一215致病性测试用无菌注射器将悬浮液注射到小麦、番茄、辣椒和黄瓜的苗茎基部，每苗015mL。保湿24h,3d后开始观察苗基部是否出现病斑，10d后统计发病情况。结果表明，经YM2YM9处理的幼苗均未见发病株，、番茄、辣椒和0%、0%

15、。因，、番茄、辣椒和黄，。土壤农药残留、盐碱化等存在的多种问题，成为今后可持续发展农业和生态农业发展必须考虑的问题。而目前研制的微生物肥料，功能少，对盐碱等逆境条件适应性差，效果不稳定，作用范围窄。尽管有固氮菌属（Azotobacter的耐盐菌株被分离13,14,但多数高效固氮菌株不耐盐碱条件，具固氮酶对Na离子比较敏感40本试验用的固氮菌株YKT41属于圆褐固氮菌（Azotobacterchroococcum，耐盐碱能力差，在盐碱地区施用效果不理想，难以发挥其增产抗病功能。因此笔者采用原生质体融合技术将耐盐菌MNY2与之细胞融合。试验结果表明融合效率高，其中融合子YM2和YM9均明显表现双亲

16、的优良性状，固氮能力较YKT41还有所提高，并具有明显的耐盐碱能力。这对于提高菌株抗逆性，扩宽使用范围有重要意义。该实验也表明，通过原生质体融合技术构建多功能融合菌株可行、有效，为组建有益于农业发展，具有多种优良性状的新型菌株的探索提供新的理论依据和技术支持。止匕外，利用原生质体融合技术构建的融合子对环境安全，避免了转基因工程可能造成的潜在的威胁，值得我们广泛地研究和探讨。参考文献：1卢志军，刘深，刘西莉.枯草芽抱杆菌HL29与根瘤菌88一中国土壤与肥料2010（2XJ83097原生质体融合以及融合子特性的初步研究J.植物病理学报，2005,35(6:108-110.2余荔华，刘进元，南明.克

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21、ces,KeyLabforAppliedMicrobiology,Jinan250014;2.CollegeofLifeScience,ShandongUniversityofogy,Zibo255049AbstractnordertoimprovesalttoleranceofthemultifunctionalAzotobacterYKT41(Azotobacterchroococcum,interfa2milialprotoplastfusionbetweensalt2tolerantstrainsMicrococcussp.MNY2andthestrainYKT41wasperform

22、ed.Afterre2peatedlytransferringexperimentuptotwelvegenerationsonselectiveandnon2selectiveculturemedium,15strainsofstablefusantswereobstained,biologicaltestsshowedthatfusantYM2andYM9exhibitedthedesirablecharacteristicsofboththeparentalstrains,suchasnitrogenfixation,halotolerant,fungicidalactivity.Keywords:Azotobacter;salt2tolerantstrains;protoplastfusion;fungicidalactivityt接第7