色谱和毛细管电泳在中药现代化过程中的作用

1、色谱和毛细管电泳在中药现代化过程中的作用众所周知，中药现代化有一个必须解决的关键问题就是质量控制标准。虽然目前西方发达国家医药市场已逐渐开始接受天然复方药物，承认中药复方的临床疗效和安全性，但是，如何有效控制中药的质量仍然是一个尚未解决的问题，这在很大程度上限制了中药的临床应用，阻碍了中药的国际化进程。鉴于中药本身的药理特性和成分复杂性，加之目前药材来源的多样性、生产工艺的不规范和分析要求的特殊性，美国食品药品管理局（MND）、世界卫生组织（OJC）、欧共体、英国、印度和加拿大草药典E均接受指纹图谱作为申报材料的组成部分。不过，这大多是针对保健性植物药的，对于临床用药品则尚无此类规定。因此，中

2、药的质量控制标准仍是一个亟待解决的国际性难题。这无疑是一个严峻的挑战，但同时又是我们在该领域做出世界领先水平工作的契机。从!"世纪9"年代将薄层扫描图谱用于中成药分析，到&"年版中国药典设置薄层色谱鉴别对照药材，再到!"""年国家药品监督局发布“中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）”，我国中医界对指纹图谱在中药质量控制中的作用已经达成了重要的共识，并提出了色谱指纹图谱(和中药材特征性总成分指纹图%等概念，已有不少JKL9、I8、核磁共振（PQG）、红外光 谱（MRSG）和荧光光谱&"等技术用于指纹图谱分析

3、的报道。指纹图谱不要求呈现在图谱中的每一个组分的化学结构都清楚，也不要求对每个组分都精确定量，但要求图谱具备指纹特征，即专属、稳定、实用，凭借指纹图谱可确认产品的真伪，且能判断质量稳定与否&&。现代分析仪器的发展已可提供用于指纹图谱分析的强有力技术，特别是色谱和毛细管电泳这样的分离分析方法及其与质谱的联用技术，可以提供多维的数据。比如采用毛细管柱I或顶空气相色谱（JFI）可以获得中药中可挥发性成分的谱图&!；采用裂解气相色谱（K>$I）可以获得药物成分降解产物的信息&#；采用 JKL&E，&(则可以获得中药中难挥发和不挥发成分的谱图。)由于

4、分离效率高，适用样品范围广，分析成本低而得到广泛的应用，在中药指纹图谱研究中已有不少报道&%，比如，十大功劳药材&9和栀子药材&8的)指纹图谱等。然而，必须承认，中药指纹图谱的研究才刚刚起步由于指纹图谱分析是一项极为复杂的系统工程，原料药材和成药的组成和疗效又受许多因素的影响，故要将色谱或)指纹图谱作为普适而有效的质量标准尚有很多必须解决的问题。原料药材的质量稳定性和投料物的选择、用于不同药材和制剂的指纹图谱分析的技术确定和方法验证、数据处理的规范和图谱解析标准&、优良实验室规范（ILK）、优良制造规范（IQK）和整个分析方法的自动化问题等等，均需要做全面而系统

5、的研究。" 有效成分的提取和测定虽然指纹图谱肯定是建立中药质量标准的一条途径，但仅仅靠指纹图谱恐怕还不能完全解决毕竟经过祖辈几千年的积累，又有现代中国几十年!""#年9月T0->!""#色 谱!"#$%&%()*$+,(-!"*(.+/(0*+1"2U;-3!&P;3E#"9"#&"的研究，我们在中药有效成分的分离鉴定方面已经获得了丰富的知识，已经可以准确分析和测定许多中药的有效成分。我们认为，有效成分的定量分析与指纹图谱的研究是中药质量评价的两个重要方面

6、，缺一不可。二者的有效结合，才是建立中药质量标准的有效途径。在中药有效成分的提取和测定方面，色谱和!"技术一直扮演着主要的角色。从早期的以薄层色谱为主，到后来#!和$%&!的应用越来越普遍，再到近十年来!"的异军突起，使得中药有效成分的提取分离和测定技术日趋先进。目前，$%&!在中药有效成分的分析方面发挥着不可替代的作用，(，而近年来快速发展的!"技术则是液相色谱的有力补充，因为!"有多种分离模式，切换方便且分析成本低，很适合于复杂样品的分离分析。在基因测序、蛋白质分析和手性药物分离方面，!"已经显示了强大的优势。在中药分析中也

7、已经有大量的文献报道)，所 涉 及 的 方 法 有 毛 细 管 区 带 电 泳（!*" ）!+、 胶 束 电 动 毛 细 管 色 谱（,"-!）.!/、微乳电动色谱（,""-!）/，/0非水毛细管电泳（12!"）/3、毛细管电色谱（!"!/4等，分析对象包括中草药中的各类物质（包括酸性、碱性和中性的物质），如有机酸生物碱、黄酮及其甙类、香豆素类、氨基酸类、蛋白质类及皂甙等成分的分析。利用!"的快速分离特征，还可以研究植物生长环境如空间失重条件对中药质量的影响/5。研究结果表明，不同的模式可用于同一类有效成分的分析，但选择性不

8、同/+；!"不仅是$%&!很好的补充，而且在很多方面优于$%&!，比如，!"所采用的毛细管柱易于清洗、易于平衡，且成本低/.。然而，就中药有效成分分析而言，!"在重复性和检测灵敏度方面尚不及 $%&!。原因是!"中影响电渗流的因素较多，人们对高电场作用下熔融石英毛细管内表面的物理化学性质还缺乏充分的认识，而大部分中药组分极其复杂，某些组分可能与毛细管内壁发生相互作用，导致进样分析过程中毛细管内表面性质的变化，从而造成电渗流的不重复。采用相对迁移值和叠加对比法可以在一定程度上克服重复性差的问题0(。另一方面，目前大部分!"

9、配备紫外吸收（67）或二极管阵列检测器（828）进行柱上检测，由于光程（毛细管内径一般为3(!)("9）较短，进样量有限（/(:&左右），故难以检测样品中的微量成分，特别是当这些微量成分是中药的有效成分时，就难以准确判定样品的质量。因此，深入研究熔融石英管内表面的物理化学性质，开发新的涂层技术、制备电渗流稳定或精确可控的毛细管，开发成本低、灵敏度高且通用性好的检测器，无疑是中现代化过程中!"研究的重要内容。目前改善!"检测灵敏度主要有三个途径。一是采用电喷雾谱（"<=,;）、激光诱导荧光（&<>）或电化学检测等高灵敏度检

10、测器。但前二者成本高，普及有困难，而且"<=,;对缓冲盐的应用有较苛刻的要求，&<>则需要对很多无荧光特性的物质进行柱前或柱后的标记；电化学检测器的通用性较差，电极的耐用性和重复性尚不能令人意。二是研究柱上浓缩或样品堆积技术。对某些样品成分，适当的浓缩可以使检测灵敏度提高百倍到上千倍，这是很有意义的研究。三是进行分析前样品预处理。采用包括超临界流体萃取膜提取分离、超声提取、微波萃取、酶法、半仿生提取法、破碎提取法、空气爆破法、液泛法、大孔树脂吸附分离以及双水相萃取等高效提取工艺0)，0，比如高速逆流色谱对中药有效成分的提取就非常有效0/!04。最近，分子印迹

11、聚合物（,<%）用于中药有效成分的固相萃取（;%"）显示了诱人的结果，徐筱杰教授的研究组05用;%"直接提取了银杏叶中的黄酮。最近他们以抗表皮生长因子受体抑制剂（中药有效成分）为模板分子合成了具有特殊选择性的 ,<%，以此填充;%"小柱，从中药中萃取了有关活性成分0+；进而他们此类 ,<%作亲和色谱固定相，采用液相色谱=质谱在线联用技术（&!=,;）选择性分离和鉴定中药中的抗癌成分0.。若将此类技术应用于!"分析的样品处理，或者用于亲和!"!以及!"!=,;对中药有效成分的分离分析，必将进一步推动!"

12、;在中药有效成分分析中的应用。! 活性成分的筛选过去的几十年里，在分子水平上高通量筛选药物先导化合物已经成为新药开发的主手段。中药的药理作用主要是基于分子水平上多成分、多靶点的组合作用，采用单一靶蛋白中药中的活性成分难以取得满意的结果。借鉴西药的研究方法来筛选中药活性成分也是中药现代化研究的一个重要方面，而$%&!和!"在这方面无疑是极为重要的技术。日本学者曾以或动物为筛选模型，结合$%&!分离分析，对传统中药复方小柴胡汤的有效成分进行了筛选究3(；我国学者则提出了基于药中多种活性成分的分离分析3)。可用于中药的筛选3，固定化脂质体色谱也是一种有效的方法3/。近来，有

13、人又明确提出了生物功能化色谱的概念30，即将生物活性分子作为色谱固定相，或者键合到固定相上，使其具有某些生物的功能，在模拟生物条件下，对药物分子进行分离，从而·/(+· 色 谱 第)卷" 有效成分的提取和测定虽然指纹图谱肯定是建立中药质量标准的一条途径，但仅仅靠指纹图谱恐怕完全解决问题。毕竟经过祖辈几千年的积累，又有现代中国几十年!""#年9月T0->!""#色 谱!"#$%&%()*$+,(-!"*(.+/(0*+1"2U;-3!&P;3E#"9"#&

14、amp;"的研究，我们在中药有效成分的分离鉴定方面已经获得了丰富的知识已经可以准确分析和测定许多中药的有效成分。我们认为，有效成分的定量分析与指纹图的研究是中药质量评价的两个重要方面，缺一不可。只有二者的有效结合，才是建立中药质量的有效途径。在中药有效成分的提取和测定方面，色谱和!"技术一直扮演着主要的角色。从早期的以薄层色谱为主，到后来#!和$%&!的应用越来越普遍，再到近十年来!"的异军突起，使得中药有效成分的提取分离和测定技术日趋先进。目前，$%&!在中药有效成分的分析方面发挥着不可替代的作用，(，而近年来快速发展的!"技术则是液相

15、色谱的有力补充，因为!"有多种分离模式，切换方便，且分析成本低，很适合于复杂样品的分离分析。在基因测序、蛋白质分析和手性药物分离方面，!"已经显示了强大的优势。在中药分析中也已经有大量的文献报道)，所 涉 及 的 方 法 有 毛 细 管 区 带 电 泳（!*" ）!+、 胶 束 电 动 毛 细 管 色 谱（,"-!）.!/、微乳电动色谱（,""-!）/，/0、非水毛细管电泳（12!"）/3、毛细管电色谱（!"!）/4等，分析对象包括中草药中的各类物质（包括酸性、碱性和中性的物质），如有机酸、生物碱、黄酮及其甙类、香

16、豆素类、氨基酸类、蛋白质类及皂甙等成分的分析。利用!"的快速分离特征，还可以研究植物生长环境如空间失重件对中药质量的影响/5。研究结果表明，不同的模式可用于同一类有效成分的分析，但选择性不同/+；!"不仅是$%&!很好的补充，而且在很多方面优于$%&!，比如，!"所采用的毛细管柱易于清洗、易于平衡，且成本低/.。然而，就中药有效成分分析而言，!"在重复性和检测灵敏度方面尚不及 $%&!。原因是!"中影响电渗流的因素较多，人们对高电场作用下熔融石英毛细管内表面的物理化学性质还缺乏充分的认识，而大部分中药组分极其复杂某些组分

17、可能与毛细管内壁发生相互作用，导致进样分析过程中毛细管内表面性质的变化，从而造成电渗流的不重复。采用相对迁移值和叠加对比法可以在一定程度上克服重复性差的问题0(。另一方面，目前大部分!"配备紫外吸收（67）或二极管阵列检测器（828）进行柱上检测，由于光程（毛细管内径一般为3(!)("9）较短，进样量有限（/(:&左右），故难以测样品中的微量成分，特别是当这些微量成分是中药的有效成分时，就难以准确判定样品的质量。因此，深入研究熔融石英管内表面的物理化学性质，开发新的涂层技术、制备电渗流稳定或精确可控的毛细管，开发成本低、灵敏度高且通用性好的检测器，无疑是中药现代化过

18、程中!"研究的重要内容。目前改善!"检测灵敏度主要有三个途径。一是采用电喷雾质谱（"<=,;）、激光诱导荧光（&<>）或电化学检测等高灵敏度检测器。但前二者成本高，普及有困难，而且"<=,;对缓冲盐的应用有较苛刻的要求，&<>则需要对很多无荧光特性的物质进行柱前或柱后的标记；电化学检测器的通用性较差，电极的耐用性和重复性尚不能令人意。二是研究柱上浓缩或样品堆积技术。对某些样品成分，适当的浓缩可以使检测灵敏度提高上百到上千倍，这是很有意义的研究。三是进行分析前样品预处理。采用包括超临界流体萃取、膜提取分离

19、、超声提取、微波萃取、酶法、半仿生提取法、破碎提取法、空气爆破法、液泛法、大孔树脂吸附分离以及双水相萃取等高效提取工艺0)，0，比如高速逆流色谱对中药有效成分的提取就非常有效0/!04。最近，分子印迹聚合物（,<%）用于中药有效成分的固相萃取（;%"）显示了诱人的结果，徐筱杰教授的研究组05用;%"直接提取了银杏叶中的黄酮。最近他们以抗表皮生长因子受体抑制剂（中药有效成分）为模板分子合成了具有特选择性的 ,<%，以此填充;%"小柱，从中药中萃取了有关活性成分0+；进而他们以此类 ,<%作亲和色谱固定相，采用液相色谱=质谱在线联用技术（&!=,;）选择性分离和鉴定了中药