血吸虫抗体快速检测试剂盒综述资料

1、血吸虫抗体快速检测试剂盒的综述资料1、 产品预期用途1.1产品预期用途：血吸虫抗体快速检测试剂盒（斑点免疫金渗滤法）简称试剂盒，是用于体外定性人血清中是否有血吸虫抗体，是用于诊断血吸虫病的依据，也是血吸虫病预防控制的基础、流行病学调查的工具、疫情监测的手段。1.2与预期用途有关的临床适应症背景情况：血吸虫病免疫学诊断方法是十分可靠的辅助诊断依据，也是流行病学调查最常用的工具。1.3相关的临床或实验室诊断方法及产品现状等：血吸虫病是一种严重威胁人类健康的流行性传染病，发展有效的诊断筛查方法能促进血吸虫病流行的预防控制工作。国内外已建立用于血吸虫病诊断的病原学、免疫学及分子生物学等多种方法，病原学

2、诊断方法（粪便查虫卵）由于敏感性较低，分子生物学方法（如PCR）需要特殊的仪器设备，均难以在流行区现场推广。目前，常用的血吸虫病现场筛查方法仍以免疫学方法为主，如酶联免疫吸附法（ELISA）、环卵沉淀（COPT）、间接血凝（IHA）。 随着现代免疫理论和技术的进步，免疫学检测技术得到了不断发展和更新，快速简便，易于操作的免疫学诊断方法更易于被医技人员，尤其是现场防治人及患者所接受。上海疾控生物科技有限公司生产的“血吸虫抗体快速检测试剂盒”操作简便，不需要使用仪器设备，结果易于判读，适合于各级医疗卫生机构及现场血吸虫病防治人员使用。此方法纳入了中华人民共和国卫生行业标准 血吸虫病诊断标准（WS2

3、61-2006）目前国内外尚无类似产品。2、产品描述2.1 产品所采用的技术原理：氯金酸(HauCI )在还原剂的作用下可聚合成一定大小的金颗粒，形成带负电的疏水胶溶液称胶体金。胶体金颗粒表面带有负电荷与蛋白质等生物大分子的正电荷基团因静电作用形成牢固结合，而蛋白质的生物活性无明显的改变。当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点。2.1.1血吸虫抗体试剂盒测定原理：斑点免疫金渗滤法（Development of dot immunogold filtration assay，DIGFA)是以硝酸纤维素膜为载体，利用微孔膜的可滤过性和毛细管作用，使抗原抗体反应在一个特殊的渗

4、滤装置上，以液体渗滤过膜的方式迅速完成。渗滤装置为一充满吸水垫料的塑料小盒，在盒盖中央的小孔下面放置了一片硝酸纤维素膜，膜上预包被血吸虫抗原斑点，试验时将血清滴加在膜上，通过渗滤使抗原抗体在膜上发生免疫结合反应，然后滴加金标结合物，使其与对应的抗体结合并显色，阳性结果在膜上出现红色斑点，反之，则为阴性结果。斑点颜色的深浅相应地提示阳性强度。2.1.2试剂盒产品的组成：试剂盒是由检测盒、洗涤液、显色液组成。检测盒为ABS 材料制成的一个白色带孔塑料盒，塑料盒孔内的滤膜上包被有点状可溶性血吸虫抗原的检测点及人IgG的质控点。 洗涤液由TBS、吐温20组成。显色液由氯金酸、鞣酸-柠檬酸钠、羊抗人Ig

5、G组成。2.1.3测定主要参数试验方法：将试剂盒取出，置于室温下回暖，编号；在检测盒中央小孔内滴加2滴洗涤液，渗入后于反应板中央加25 l 受检血清，待液体充分吸入，加2滴洗涤液，渗入后加4滴显色液，最后加2滴洗涤液，渗入后即可判断结果。出现两个红色斑点为阳性，出现一个红色斑点为阴性，无斑点表示结果无效。（洗涤液与显色液每滴约为40ul）2.2 主要原材料来源及制备方法2.2.1 产品的组成 洗涤液 TBS、吐温20 显色液 氯金酸、鞣酸-柠檬酸钠、羊抗人IgG 检测点试液 0.2 mg/ml 质控点试液 0.01mol2.2.2主要原料的规格来源 洗涤液 外购 显色液 外购 【由上海市疾病预

6、防控制中心提供】 检测点原料 外购 【由上海市疾病预防控制中心提供】 检测点试液 自制 质控点试液 自制 塑料盒 定制 吸水纸 符合GB/T 20808-2006 外购 【国产】 硝酸纤维素膜 外购 【进口】2.2.3主要原料的制备方法2.2.3.1血吸虫可溶性虫卵抗原（SEA）（试剂盒检测点原料）（1）制备方法：取人工感染1500条日本血吸虫尾蚴45d的家兔肝脏，用生理盐水洗净后经高速捣碎机捣碎，分样筛分离除去肝脏组织，沉淀离心，收集分离虫卵，依次经200目和300 目尼龙绢过滤，收集滤渣，即为较纯净的血吸虫虫卵。然后加入10倍量的生理盐水，置玻璃匀浆器内制成匀浆，用超声粉碎机超声处理（1m

7、in10次），液氮冻融3次，最后以10 000 r/ min 离心30 min ，上清液即为血吸虫可溶性虫卵抗原（SEA），经0.22um超滤膜过滤除菌后分装，20冻存备用。（2）工作浓度：SEA 的作用是作为检测点，包被于硝酸纤维素膜上，用于检测人血清中特异性抗血吸虫抗体。因此，其工作浓度的选择对于检测效果的评价是试剂盒研制的关键技术。如果浓度过高，阳性反应色度过强，易产生假阳性结果；反之，浓度过低，则不易辨别，影响检测的灵敏度2.2.3.2金标二抗（试剂盒显色液原料）（1）制备方法：a. 胶体金制备采用鞣酸-柠檬酸钠还原法，胶体金颗粒直径为20 nm。具体方法为：取1%氯金酸5ml溶于39

8、5 ml dH2O，加热至60 ，快速加入鞣酸-柠檬酸钠溶液100 ml（1%柠檬酸三钠20 ml，1%鞣酸0.05 ml，dH2O 80 ml），加热煮沸15 min，溶液颜色由黑逐渐变为亮红色。冷却后用0.1 mol/L碳酸钾调溶液pH至8.0。金标二抗制备二抗为亲和层析法纯化的羊抗人IgG(上海神航生物科技有限公司，蛋白浓度为3.34mg/ml，批号：IP2030)。最适蛋白稳定量选择：将待标记的二抗分别加到 1ml胶体金溶液中，另设一管不加蛋白质的对照管，分钟后加入0.1ml 10NaCl溶液，混匀后静置小时观察结果，红色不变者为能使胶体金稳定的蛋白量，再加20即为最适标记蛋白量。2.

9、2.2.3 人IgG（试剂盒质控点原料）（1）制备方法：采用辛酸提纯法从健康献血者血清中提取人IgG。经0.22um超滤膜过滤除菌后分装，2ul/支，置冻干机抽成干粉，-20保存。临用时每支加工作浓度的PBS复溶即可。（2）工作浓度：人IgG的作用是作为质控点，包被于硝酸纤维素膜上，能够与金标二抗结合，产生红色圆点，以此判断金标二抗处于有效期内；如不能出现红色圆点，则金标二抗失效。因此，试验目的就是选择能清晰产生反应色度的人IgG浓度。2.2.2.4说明上述原料均系上海市疾病预防控制中心作为本产品技术成果转化的配套提供给本公司。2.3 主要生产工艺过程2.3.1 试液（显色液、洗涤液）分装：准

10、备分装清场确认2.3.2试剂盒： 准备吸水纸折叠塑料盒组装试剂溶液（检测点试液、质控点试液）配制检测点质控点包被内包装清场确认2.3.3 外包装： 准备试液、试剂盒、标签质量判定外包装清场确认2.3.4 产品生产的工艺环境控制 为保证试剂盒产品的稳定，本公司按试剂生产管理相关法规规定，对产品生产过程的环境实施了净化（10万级）控制措施，并建立实现了产品实现的追溯管理，以保证产品的使用性能，在符合产品标准规定的同时，满足临床检测筛选诊断的精度要求。2.4 质控品的制备方法及溯源情况 本公司的质控品用途是对产品出厂前的性能检测，由上海市疾病预防控制中心在提供检测点试液时配套提供，进厂入库前均由上海

11、市疾病预防控制中心出具检验报告。本质控品是参照“血吸虫病抗体诊断试剂国家参考品” （中国药品生物制品检定所 批号：20041108）低感染度抗体水平(P13)制备，作为斑点免疫金渗滤法血吸虫抗体阳性临界值参照。3、生物安全性及废品处理血吸虫抗体快速检测试剂盒（斑点免疫金渗滤法）主要成分是血吸虫虫卵抗原及人IgG，是生物活性蛋白，在生物活性传染性物质名录中，血吸虫抗原和人IgG没有被列入其中。同时，经过上海市疾病预防控制中心多年的实践经验，均无生物污染及危害性。一旦不慎溅入眼睛，可立即用水冲洗。试剂用塑料瓶装外用纸盒打箱，基本无泄漏，运输中不会污染环境，塑料瓶和纸箱由医院按医疗垃圾处理。医院在检

12、验过程中使用的血清标本，则按医院管理的相关制度执行灭活处理。4、产品主要研究结果的总结和评价4.1 主要研究结果的总结 胶体金斑点免疫渗滤法是上世纪90年代以来我国血吸虫病免疫诊断上新出现的方法，其优势在于操作简便、反应快速，不需任何专门设备，不需工作人员特殊培训，既可用于大规模血清流行病学调查，又能作为单份检测个别病例的免疫学诊断工具。经中国科学院上海科技查新咨询中心评价，综合技术在国内处于领先，并达到国际先进水平。因此本公司在 2008 年引进了由上海疾控中心的研制成果，胶体金斑点免疫渗滤法的血吸虫抗体快速检验试剂盒的生产技术，并经产业化转换，已实现产品生产工艺的完备，产品的定型标准化以及

13、临床适用性的验证工作。使之成为具有临床实际使用意义的医疗器械筛选类试剂。4.2 对试剂盒的评价4.2.1 性能分析评价根据最佳条件组成的试剂盒对血吸虫病抗体诊断试剂国家参考品的测试结果，显示出阴、阳性参考品的检测符合率均高于90 %，灵敏度为1:4，精密度测试10次均为阳性，显色均匀一致，均符合国家参考品的检测质量要求（表1）。表1 血吸虫病抗体诊断试剂国家参考品的测试结果Table1. Results of detecting the national reference IgG serum of schistosomiasis by dot immunogold filtration as

14、say（DIGFA）kit.血清Sera份数No. sera 阴性(数)No. negative阳性(数)No. positive符合率（%）Coincident rates阴性参考品Negative reference sera15150100阳性参考品Positive reference sera15015100灵敏度参考品Detectable minimum reference sera4(1:21:16)2（1:8；1:16）2 (1:2；1:4)1:4精密度参考品Precision reference sera10010100血吸虫病抗体强度依次为、+、+、+The intensit

15、y of antibody to schistosomiasis is 、+、+、+, respectively.图1 金标渗滤法检测血吸虫病抗体强度效果图 Fig.1 Results of detecting the intensity of antibody to schistosomiasis by dot immunogold filtration assay（DIGFA）4.2.2稳定性：试剂盒在稳定性及加速破坏性实验中，对15份阳性参考血清和15份阴性参考血清及灵敏度、精密度检测血清的检测结果表明：从加速破坏性实验来看，试剂盒在37保存5天后，阳性检出率和阴性检出率可保持不变，灵敏

16、度高于1：4，精密度好；4条件下保存180天后，阳性检出率和阴性检出率保持不变，灵敏度高于1：4，精密性好。且两者阳性反应的强度均未见减弱。4.2.3现场效果测评4.2.3.1 设计方案：根据临床研究方案要求，本临床试验以2种粪检（Kato-Katz法和毛蚴孵化法）结果作为血吸虫病阳性诊断金标准，以无血吸虫感染史、无血吸虫疫水接触史且粪检结果阴性作为血吸虫阴性诊断金标准，在流行区筛选血吸虫病患者（金标准阳性）和非流行区选择阴性对照者（金标准阴性）作为临床试验对象。试验对象总数不少于1000例，按要求采集试验对象的血清样本。在各实验室将所有血清样本（阳性和阴性）次序混和后重新随机排列、分别将血清

17、吸入新编次序的血清管中制备成血清盘，由统计人员管理原始编号和新编号信息。由经过培训的操作人员用血吸虫抗体快速检测试剂盒对血清盘进行检测和结果判断，整个试验中对临床试验的操作人员和结果判断者实行双盲，试验结束后由统计人员将检测结果与金标准判定结果进行比较分析，计算血吸虫抗体快速检测试剂盒的阳性符合率（敏感性）和阴性符合率（特异性）等指标。4.2.3.2 现场测评结果本次临床实验共收集1132份血清，采用上海疾控生物科技有限公司的试剂盒与金标准进行同步盲法检测；运用灵敏度、特异度、调整一致性、约登指数这几个指标对该诊断试剂进行评价。 检验结果见下表:诊断试剂 敏感度 特异度 调整一致性 约登指数

18、试剂盒 94.2% 97.2% 93.7% 0.912 从上述表中可以看出，试剂盒灵敏度较高，与病原学阳性的血清检测结果基本一致。 采用调整一致性、约登指数进行分析，说明试剂盒检测结果与金标准检测结果之间具有较好的真实性，对判断阳性和阴性结果具有较强的准确性。能够准确鉴别具有患病人群和正常人群能力。4.3 结论：上海疾控生物科技有限公司生产的血吸虫抗体快速检测试剂盒（斑点免疫金渗滤法）。具有以下特点1. 快速：全部检测过程仅需1-2分钟。2. 简便：不需其它任何仪器设备，操作也极其简单，可随时随地进行。3. 可单份检测：对标本既能成批检测，又可单份检测，患者可立刻拿到结果，不必等待。4. 高敏感性和特异性该试剂盒不存在放射性危害可以在临床检验及疫区血防所进行大规模筛查使用，为日本血吸虫病的诊断和治疗提供有效的依据。5、其他本产品是上海市疾病预防控制中心寄生虫病研究室多年研究的成果，作为技术成果转化的产物，由上海疾控生物科技有限公司按体外诊断