细胞实验二细胞损伤与保护2ppt课件

1、细胞实验二细胞实验二细胞损伤与维护细胞损伤与维护2 设3组不同的细胞组 正常、损伤、损伤恢复 用不同的实验方法检测、验证明验结果 实验内容细胞电子显微镜检测细胞电子显微镜检测细胞活率测定细胞活率测定亚细胞构造的分别与鉴定亚细胞构造的分别与鉴定实验设计实验设计1. 电镜每班传细胞入含小盖片培育瓶电镜每班传细胞入含小盖片培育瓶6瓶瓶 2组组 2瓶正常、瓶正常、4瓶损伤、第二天瓶损伤、第二天2瓶损伤后恢复瓶损伤后恢复2. 活率每组传细胞入活率每组传细胞入96孔培育板孔培育板9孔孔 3孔正常、孔正常、6孔损伤、第二天孔损伤、第二天3孔损伤后恢复孔损伤后恢复3. 分别每班传代细胞分别每班传代细胞8瓶瓶

2、4瓶细胞瓶细胞1传传2至至25ml培育瓶成培育瓶成8瓶细胞瓶细胞细胞电子显微镜检测细胞电子显微镜检测细胞电镜标本制备细胞电镜标本制备原原 理理 光学显微镜无法看清小于0.2um的细微构造，我们把这些细微构造称为亚显微构造submicroscopic structures或超微构造ultramicroscopic structures；ultrastructures。要看清这些构造，就必需选择波长更短的光源，以提高显微镜的分辨率。 电子显微镜与光学显微镜 的构造，从原理上来说是类似 的，但也有不同之处。 首先不同的是用电子束电子流替代照明光源。 其次，电镜运用的是电子透镜，而不是光学透镜，电子透

3、镜不是肉眼可见的物质透镜，它是由磁或电所构成的磁场或电场的部分空间来起到透镜的作用。 第三个区别是成像原理不同。其成像是由于标本中不同构造中原子与电子发生碰撞后，呵斥电子散射角度不同，使荧光屏上的电子强度也相应不同。 电镜制样技术电镜制样技术 由于电子束的穿透才干有限，为了获得较高分辨率，需求运用超薄切片机制成厚度普通仅为4050nm的超薄切片。这就需求样品有一定的刚性和韧性，为此，样品需求包埋在特殊的介质中。但包埋的过程会破坏样品的构造，因此超薄切片样品制备的第一步就是固定，其后依次是包埋、切片和染色。 超薄切片的制备超薄切片的制备1、固定：戊二醛和OsO4等， 锇酸后固定。2、包埋：环氧树

4、脂和丙烯酸树脂等。3、切片：玻璃刀用超薄切片机切片， 厚度4050nm，切片搜集在 铜网或镍网上，在电镜下察看。4、染色：常用的染色液是醋酸双氧铀易 染核 酸和铅盐易染蛋白质。结结 果果 在电子显微镜下察看 比对正常、损伤及损伤后恢复标本 照相 分析 总结要要 求求 送标本 照片结果分析细胞活率测定细胞活率测定MTT比色法比色法原理原理 四甲基偶氮唑盐(噻唑蓝MTT)是一种能接受原子的染料。可透过细胞膜进入细胞内。活细胞线立体中琥珀酸脱氢酶，能使外源性淡黄色的 (MTT)复原成难溶于水的结晶，并沉淀在细胞中。其构成量与活性呈正相关。该结晶物能被二甲基亚砜DMSO溶解，用酶联免疫检测仪，在波长4

5、92nm测定其光吸收值。可间接反映活细胞的数量变化。器材与试剂器材与试剂 器材：培育细胞(96孔细胞培育板) 酶标仪、移液抢、抢头等 试剂：5mg/ml MTT溶液 二甲亚砜DMSO溶液 DMEM培育液高糖、无糖 实验步骤实验步骤1、接种1.5104/ml细胞于96孔板：每组9孔2、每孔加200ul培育液：3孔正常高糖、 3孔损伤无糖、3孔损伤恢复无糖 有糖 ，37oC、5%CO2、饱和湿度下培育；3、测定前2h，每孔吸弃原培育液，加高糖培育 液180ul 、再加 MTT溶液20ul，继续培育；4、到2h测定时，每孔吸弃培育液， 加DMSO 溶液150ul，振荡5分钟；5、酶标仪492nm波优

6、点比色。5h结果结果记录酶标仪上光吸收值分析每组细胞生长情况本卷须知本卷须知 每孔的细胞密度不能超出1x105 /ml ， 防止影响实验的区分度； 高浓度血清会导致实验本底增高， 比色前尽量使血清浓度不超越10%。亚细胞构造的分别与鉴定亚细胞构造的分别与鉴定细胞核的提取细胞核的提取原原 理理 细胞内各种细胞器质量不同，在同一离心场内的沉降速度也不一样。根据这一原理，常用差速离心法、密度梯度离心法来分别各种细胞器。 分别的各种细胞器可以用组化等方法加以鉴定。 本实验利用此原理仅对细胞核进展分别、鉴定，其上清液可作进一步分别。器材与试剂 细胞株CHL 离心机、天平、离心管、显微镜、 染色缸、滴管等

7、 消化液、0.075M KCl、0.25%蔗糖溶液、 甲醇固定液、Giemsa染液操操 作作 搜集细胞消化法 离心(1000/min5 ) 沉淀加0.075M KCl 4ml，冲打，静置20min离心(1500/min10 ) 取沉淀加蔗糖溶液4ml，打匀离心2500/min10 取沉淀加少量固定液涂片酒精灯烤干甲醇固定5 Giemsa染色5 自来水冲洗吸水纸吸干玻片反面显微镜10倍或40倍下察看鉴定结结 果果 细胞核染成深兰色本卷须知本卷须知 留意正确运用离心机平衡、对称 正确运用显微镜 染液临用前稀释 PBS：Gimsa原液9：1back告告 知知 实验三Bax蛋白在不同细胞中表达差别检测免疫组化法 实验前预备 细胞模型