第十一章电泳技术

1、第十一章第十一章 电电 泳泳Electrophoresis(一）定义一）定义电移动：凡是带电的质点在电场的作用下都会向着各自的电移动：凡是带电的质点在电场的作用下都会向着各自的异性电极移动的现象，称为电移动。异性电极移动的现象，称为电移动。若带电的质点是离子，就称为若带电的质点是离子，就称为离子电泳离子电泳；胶体颗粒在电场；胶体颗粒在电场作用下的移动就称为作用下的移动就称为电泳电泳。自由电泳：带电的胶体颗粒在溶液中的移动。自由电泳：带电的胶体颗粒在溶液中的移动。区带电泳：带电的胶体颗粒在介质（支持物）中的移动。区带电泳：带电的胶体颗粒在介质（支持物）中的移动。第一节第一节 概概 述述19世纪初

2、世纪初(1808)，俄国物理学家，俄国物理学家Pece首次发现电泳现象。他在湿首次发现电泳现象。他在湿粘土中插上带玻璃管的正负两个电极，加电压后发现正极玻璃管粘土中插上带玻璃管的正负两个电极，加电压后发现正极玻璃管中原有的水层变混浊，即带负电荷的粘土颗粒向正极移动，这就中原有的水层变混浊，即带负电荷的粘土颗粒向正极移动，这就是电泳现象。是电泳现象。1937年年Tiselius利用利用U形玻管进行形玻管进行血清蛋白血清蛋白电泳，以界面折光率差电泳，以界面折光率差别分离蛋白，并首次证明了血清是由白蛋白及别分离蛋白，并首次证明了血清是由白蛋白及、球蛋白组成球蛋白组成的，即界面电泳（自由界面电泳）。的

3、，即界面电泳（自由界面电泳）。 1948年年 Wieland等发明以滤纸作为支持物，使电泳技术大为简化。等发明以滤纸作为支持物，使电泳技术大为简化。开创了利用各种固体物质（如各种滤纸、醋酸纤维素薄膜、琼脂开创了利用各种固体物质（如各种滤纸、醋酸纤维素薄膜、琼脂凝胶、淀粉凝胶等）作为支持介质的区带电泳方法。凝胶、淀粉凝胶等）作为支持介质的区带电泳方法。 近近30年来，由于采用多种新型支持物，仪器装置亦得到不断改进，年来，由于采用多种新型支持物，仪器装置亦得到不断改进，因此出现了许多新型的电泳技术。因此出现了许多新型的电泳技术。 (二）发展历史二）发展历史1、按其支持物的物理性状不同：、按其支持物

4、的物理性状不同： (1) 滤纸及其它纤维电泳：如玻璃纤维膜、乙酸纤维膜、滤纸及其它纤维电泳：如玻璃纤维膜、乙酸纤维膜、聚胺纤维薄膜。聚胺纤维薄膜。 (2) 凝胶电泳：如琼脂、聚丙烯酰胺凝胶、淀粉凝胶电泳。凝胶电泳：如琼脂、聚丙烯酰胺凝胶、淀粉凝胶电泳。 (3) 粉末电泳：如纤维素粉、淀粉、玻璃粉电泳。粉末电泳：如纤维素粉、淀粉、玻璃粉电泳。 (4) 线丝电泳：如尼龙丝、人造丝电泳。线丝电泳：如尼龙丝、人造丝电泳。 （三）区带电泳的分类（三）区带电泳的分类 2、按支持物的装置形式不同：、按支持物的装置形式不同： (1)平板式电泳：支持物水平放置，是最常用的电泳方式。平板式电泳：支持物水平放置，是

5、最常用的电泳方式。 (2)垂直板式电泳：如聚丙烯酰胺凝胶可做成垂直板式电泳。垂直板式电泳：如聚丙烯酰胺凝胶可做成垂直板式电泳。 (3)垂直柱式电泳：如聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳。垂直柱式电泳：如聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳。 3、按、按pH的连续性不同：的连续性不同： (1) 连续连续pH电泳：即整个电泳过程电泳：即整个电泳过程pH保持不变，如常用的保持不变，如常用的纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳等。纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳等。 (2) 非连续非连续pH电泳：缓冲液和电泳支持物间有不同的电泳：缓冲液和电泳支持物间有不同的pH的的电泳，如聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳，等电聚焦电泳等。电泳，如聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳，等

6、电聚焦电泳等。 4、按用途不同可分为：、按用途不同可分为： 分析电泳；分析电泳； 制备电泳；制备电泳； 定量免疫电泳；定量免疫电泳； 连续制备电泳。连续制备电泳。 5、按所用电压不同可分为：、按所用电压不同可分为： 低压电泳：低压电泳：100V500V，电泳时间较长，适于分离蛋，电泳时间较长，适于分离蛋白质等生物大分子。白质等生物大分子。 高压电泳：高压电泳：1000V5000V，电泳时间短，有时只需几，电泳时间短，有时只需几分钟，多用于氨基酸、多肽、核苷酸和糖类等小分子物分钟，多用于氨基酸、多肽、核苷酸和糖类等小分子物质的分离。质的分离。第二节第二节 电泳原理电泳原理（一）电泳的基本原理（一

7、）电泳的基本原理 设一带电分子在电场所受的力为设一带电分子在电场所受的力为F则：则： F = QX 球形分子运动时受的阻力球形分子运动时受的阻力F为：为： F = 6rV 当当F =F时，时， QX = 6rV 移项：移项： V Q X 6r =(1)带电分子所带电荷电场强度半径介质黏度迁移速度 在具体实验中：在具体实验中：V = d / t 电场强度：电场强度： X = E /IV V: :泳动速度泳动速度cm/cm/秒秒oror分分d d: :泳动距离泳动距离cmcmt t: :电泳时间电泳时间 ( (秒秒/ /分分) )X X: :电场强度电场强度 伏特伏特/cm/cm : : 泳动率泳

8、动率oror泳动度泳动度(cm/(cm/伏伏秒秒oror分分) )E E: :电压电压 常压常压(100(100500v)500v) 高压高压(500(50010000v)10000v)仅需几分钟仅需几分钟l l: :支持场的长度支持场的长度 ( (有效长度有效长度) )V=XV=d/tE/I=dIEtV当当F =F时，质点便以均匀的速度在电场中移动。将在时，质点便以均匀的速度在电场中移动。将在单位电场下质点的移动速度定义为电泳的迁移率单位电场下质点的移动速度定义为电泳的迁移率 = V / X 。V某物质某物质A在电场中移动的距离：在电场中移动的距离： dA =VA Et / I某物质某物质B

9、在电场中移动的距离：在电场中移动的距离： dB =VB Et / I两物质移动距离差为：两物质移动距离差为： d=(dA- dB)=(VA-VB) Et / I (3)若若VA = VB 则则d=0 两者不能分离两者不能分离若若VA VB 则则d 0 两者能分离两者能分离 (二二)影响电泳的因素：影响电泳的因素： 1、颗粒性质、颗粒性质 颗粒直径、形状及所带电荷量对泳动速度有较大影响。颗粒直径、形状及所带电荷量对泳动速度有较大影响。2、电场强度、电场强度 电场强度是电泳支持物上每厘米的电位降，也称电势梯电场强度是电泳支持物上每厘米的电位降，也称电势梯度。电场强度对电泳速度起着决定性作用，电场强

10、度越度。电场强度对电泳速度起着决定性作用，电场强度越高，电泳速度越快，但随着电压的增加，电流加大，产高，电泳速度越快，但随着电压的增加，电流加大，产生热效应，易使蛋白质变性而改变性质影响电泳。生热效应，易使蛋白质变性而改变性质影响电泳。 根据电泳所采用电压的不同，可分为常压和高压电泳，根据电泳所采用电压的不同，可分为常压和高压电泳，进行高压电泳应配备冷却水系统以便在电泳过程中降温。进行高压电泳应配备冷却水系统以便在电泳过程中降温。3、溶液性质、溶液性质 a. 溶液的溶液的pH值：值：决定带电颗粒解离的程度，亦即决定决定带电颗粒解离的程度，亦即决定其所带净电荷的多少。对蛋白质两性电解质而言，其所

11、带净电荷的多少。对蛋白质两性电解质而言，pH值值离离pI越远，则颗粒净电荷越多，泳动速度越快，反之则越远，则颗粒净电荷越多，泳动速度越快，反之则越慢。因此应选择合适的越慢。因此应选择合适的pH，使各种蛋白质所带电荷差，使各种蛋白质所带电荷差异较大，有利于彼此分开，为了使电泳过程溶液异较大，有利于彼此分开，为了使电泳过程溶液pH值恒值恒定，必须采用具有一定缓冲能力的缓冲溶液。定，必须采用具有一定缓冲能力的缓冲溶液。 b. 离子强度：离子强度：影响颗粒的电动电势影响颗粒的电动电势, 溶液的离子强度越溶液的离子强度越高，电动电势越小，则电泳速度越慢，反之，则越快。高，电动电势越小，则电泳速度越慢，反

12、之，则越快。 一般最适的离子强度在一般最适的离子强度在0.020.2之间。离子强度过低，之间。离子强度过低，溶液的缓冲能力减弱，不易维持所需溶液的缓冲能力减弱，不易维持所需pH值，反而会影响值，反而会影响颗粒带电荷状态影响电泳。颗粒带电荷状态影响电泳。 c.溶液黏度：溶液黏度：泳动度与溶液黏度成反比。泳动度与溶液黏度成反比。4、电渗现象、电渗现象 液体在电场中对于一个固体支持物的相对移动，称液体在电场中对于一个固体支持物的相对移动，称为电渗现象。为电渗现象。 例如，在纸电泳时，由于纸上带有负电荷，而与纸接例如，在纸电泳时，由于纸上带有负电荷，而与纸接触的水溶液因为静电感应带有正电荷，在电场的作

13、用下触的水溶液因为静电感应带有正电荷，在电场的作用下溶液便向负极移动并带动着质点向负极移动。溶液便向负极移动并带动着质点向负极移动。 假如这时进行电泳，则质点移动的表面速度是质点移假如这时进行电泳，则质点移动的表面速度是质点移动速度和由于溶液移动而产生的电渗速度的加和。动速度和由于溶液移动而产生的电渗速度的加和。 +-液相固相电渗流电渗示意图5、焦耳热：电泳过程中释放出的热量与电流强度的平方、焦耳热：电泳过程中释放出的热量与电流强度的平方成正比。成正比。6、筛孔：支持物琼脂和聚丙稀酰胺凝胶都有大小不等的、筛孔：支持物琼脂和聚丙稀酰胺凝胶都有大小不等的筛孔，在筛孔大的凝胶中泳动速度快。筛孔，在筛

14、孔大的凝胶中泳动速度快。第三节第三节 纸电泳和醋酸纤维薄膜电泳纸电泳和醋酸纤维薄膜电泳1、纸电泳是用滤纸作支持介质的一种早期电泳技术。尽、纸电泳是用滤纸作支持介质的一种早期电泳技术。尽管分辨率比凝胶介质要差，但由于其操作简单，所以管分辨率比凝胶介质要差，但由于其操作简单，所以仍有很多应用，特别是在血清样品的临床检测和病毒仍有很多应用，特别是在血清样品的临床检测和病毒分析等方面有重要用途。分析等方面有重要用途。2、纸电泳的操作方法、纸电泳的操作方法 纸电泳使用水平电泳槽；纸电泳使用水平电泳槽； 分离氨基酸和核苷酸时常用分离氨基酸和核苷酸时常用pH 23.5的酸性缓冲液，的酸性缓冲液，分离蛋白质时

15、常用碱性缓冲液；分离蛋白质时常用碱性缓冲液； 点样量为点样量为5 g100 g和和5 l10 l； 点样方法有点样方法有干点法干点法和和湿点法湿点法； 电泳时要选择好正、负极；电泳时要选择好正、负极； 电压通常使用电压通常使用210 V/cm的低压电泳，电泳时间较长。的低压电泳，电泳时间较长。对于氨基酸和肽类等小分子物质，则要使用对于氨基酸和肽类等小分子物质，则要使用50200 V/cm的高压电泳，电泳时间可以大大缩短，但必须解的高压电泳，电泳时间可以大大缩短，但必须解决电泳时的冷却问题，并要注意安全。决电泳时的冷却问题，并要注意安全。3、定性和定量方法、定性和定量方法 电泳完毕记下滤纸的有效

16、使用长度，然后烘干，用显色剂显色，电泳完毕记下滤纸的有效使用长度，然后烘干，用显色剂显色，显色剂和显色方法，可查阅有关书藉。显色剂和显色方法，可查阅有关书藉。 一般蛋白质：萘黑一般蛋白质：萘黑12B，溴芬蓝，溴芬蓝 脂蛋白：苏丹黑脂蛋白：苏丹黑B，油溶红，油溶红O 糖蛋白：西佛碱试剂糖蛋白：西佛碱试剂 氨基酸：中性茚三酮（适用电极缓冲液氨基酸：中性茚三酮（适用电极缓冲液pH64） 碱性茚三酮（适用碱性茚三酮（适用pH极低条件）极低条件） 定量测定的方法有定量测定的方法有洗脱法洗脱法和和光密度法光密度法。洗脱法是将确定的样品区。洗脱法是将确定的样品区带剪下，用适当的洗脱剂洗脱后进行比色或分光光度

17、测定。光密带剪下，用适当的洗脱剂洗脱后进行比色或分光光度测定。光密度法是将染色后的干滤纸用光密度计直接定量测定各样品电泳区度法是将染色后的干滤纸用光密度计直接定量测定各样品电泳区带的含量。带的含量。4、血清蛋白乙酸纤维薄膜电泳、血清蛋白乙酸纤维薄膜电泳 目的目的 熟悉乙酸纤薄膜电泳方法及其在分离血清蛋白中的应用。熟悉乙酸纤薄膜电泳方法及其在分离血清蛋白中的应用。原理原理 蛋白质是兼性离子。由于组成蛋白质分子的氨基酸种类和数蛋白质是兼性离子。由于组成蛋白质分子的氨基酸种类和数目不同，各种血清蛋白质的分子量和等电点也不相同。故在同目不同，各种血清蛋白质的分子量和等电点也不相同。故在同一条件下，它们

18、电泳速度各不相同，因而可以分离。一条件下，它们电泳速度各不相同，因而可以分离。 本实验以乙酸纤薄膜为支持物，利用血清中蛋白质颗粒的本实验以乙酸纤薄膜为支持物，利用血清中蛋白质颗粒的等电点大部分低于等电点大部分低于7，在，在pH8.6的缓冲液中带负电荷，在电的缓冲液中带负电荷，在电场中向正极移动，电泳后根据血清蛋白移动快慢，可依次场中向正极移动，电泳后根据血清蛋白移动快慢，可依次分为清蛋白、球蛋白的分为清蛋白、球蛋白的1、2、五个区带，染色后显五个区带，染色后显出清晰色带。出清晰色带。 乙酸纤维薄膜电泳的优点：乙酸纤维薄膜电泳的优点： 简便、快速、样品用量少、应用范围广、分离清晰、简便、快速、样

19、品用量少、应用范围广、分离清晰、没有吸附现象等。没有吸附现象等。乙酸纤维薄膜电泳的应用：乙酸纤维薄膜电泳的应用： 目前已广泛用于血清蛋白、脂蛋白、血红蛋白和同功目前已广泛用于血清蛋白、脂蛋白、血红蛋白和同功酶的分离及用在免疫电泳中。酶的分离及用在免疫电泳中。 操作操作（一）准备：（一）准备： 1、取缓冲液中浸泡的薄膜、取缓冲液中浸泡的薄膜1张。张。 2、用滤纸吸干多余水分。、用滤纸吸干多余水分。 3、识别出无光泽面。、识别出无光泽面。 4、在角上用铅笔做上记号。、在角上用铅笔做上记号。（二）点样：（二）点样： 用点样器蘸上一层血清，于膜的无光泽面（距膜边端用点样器蘸上一层血清，于膜的无光泽面（

20、距膜边端1.5厘米处点样），使血清全部渗入膜内。厘米处点样），使血清全部渗入膜内。 （+）（-）1.5cm(三三)电泳：电泳： 1、将膜点样面向下，两端拉紧贴于电泳槽架的纱布垫、将膜点样面向下，两端拉紧贴于电泳槽架的纱布垫上，点样端在阴极，盖上槽盖。上，点样端在阴极，盖上槽盖。 2、电压、电压110-120 v ，40-50分钟。分钟。 3、关闭电源。、关闭电源。 (四四)染色：染色： 1、取出膜条，浸入氨基黑、取出膜条，浸入氨基黑10B染色液中，染色染色液中，染色2-5分钟。分钟。 2、取出薄膜，立即浸入漂洗液中，漂洗、取出薄膜，立即浸入漂洗液中，漂洗3-4次至背景无次至背景无色为止。色为止

21、。 血红蛋白从正极到负极分别是：清蛋白、球蛋白的从正极到负极分别是：清蛋白、球蛋白的1、2、 5、血清脂蛋白琼脂糖电泳、血清脂蛋白琼脂糖电泳原理 血清脂蛋白经苏丹黑B染色后，以琼脂糖为载体，在pH8.6巴比妥缓冲液中进行电泳，可将脂蛋白分成不同的区带。按电泳移动的速度不同，正常人血清脂蛋白可出现三条区带，从阴极到阳极依次为脂蛋白(最深)、前脂蛋白(最浅)，脂蛋白(比前脂蛋白略深些)。 脂蛋白前脂蛋白脂蛋白 琼脂糖主要通过氢键而形成凝胶。电泳时因凝胶含水琼脂糖主要通过氢键而形成凝胶。电泳时因凝胶含水量大（量大（9899%），近似自由电泳，因为固体支持物），近似自由电泳，因为固体支持物的影响少，故

22、电泳速度快，区带整齐。而且由于琼脂的影响少，故电泳速度快，区带整齐。而且由于琼脂糖不含带电荷的基团，电渗影响很少，是一种较好的糖不含带电荷的基团，电渗影响很少，是一种较好的电泳材料。不同浓度的琼脂糖可得到不同孔径的凝胶，电泳材料。不同浓度的琼脂糖可得到不同孔径的凝胶，一般在一般在13%，通常用巴比妥缓冲液（，通常用巴比妥缓冲液（pH8.2）配制凝）配制凝胶。胶。 检测时采用检测时采用免疫沉淀反应免疫沉淀反应：当抗原与相应抗体形成一：当抗原与相应抗体形成一个接触面时，如二者比例适当，接触面上可形成一个个接触面时，如二者比例适当，接触面上可形成一个乳白色的环状物即为阳性沉淀反应。乳白色的环状物即为

23、阳性沉淀反应。 第四节第四节 琼脂（糖）凝胶免疫电泳琼脂（糖）凝胶免疫电泳免疫电泳免疫电泳免疫电泳免疫电泳(immunoelectrophoresis，IEP)是将是将区带电泳区带电泳与与双向免疫扩散双向免疫扩散相相结合的一种免疫化学分析技术。先将结合的一种免疫化学分析技术。先将蛋白质抗原在琼脂平板上进行电泳，蛋白质抗原在琼脂平板上进行电泳，使不同的抗原成分因所带电荷、分子使不同的抗原成分因所带电荷、分子量及构型不同，电泳迁移率各异而彼量及构型不同，电泳迁移率各异而彼此分离。然后在与电泳方向平行的琼此分离。然后在与电泳方向平行的琼脂槽内加入相应抗体进行双向免疫分脂槽内加入相应抗体进行双向免疫分

24、散。分离成区带的各种抗原成分与相散。分离成区带的各种抗原成分与相应抗体在琼脂中扩散后相遇，在二者应抗体在琼脂中扩散后相遇，在二者比例合适处形成肉眼可见的弧形沉淀比例合适处形成肉眼可见的弧形沉淀线。根据沉淀线的数量、位置和形状，线。根据沉淀线的数量、位置和形状，与已知的标准与已知的标准(或正常或正常)抗原抗体形成抗原抗体形成的沉淀线比较，即可对样品中所含成的沉淀线比较，即可对样品中所含成分及其性质进行分析、鉴定。分及其性质进行分析、鉴定。 对流免疫电泳对流免疫电泳 对流免疫电泳对流免疫电泳(counter immunoelectrophoresis, CIEP) 是将双向免疫是将双向免疫扩散与电泳相结合的一种技术。在扩散与电泳相结合的一种技术。在pH8.6的缓冲液中，蛋白质抗原带的缓冲液中，蛋白质抗原带负电荷向正极泳动；而抗体大部分属于负电荷向正极泳动；而抗体大部分属于Ig，由于分子量大，暴露的极，由于分子量大，暴露的极性基团较少，在离子琼脂中泳动缓慢，同时受电渗作用的影响向负极性基团较少，在离子琼脂中泳动缓慢，同时受电渗作用的影响向负极泳动泳动 (电渗是指在电场中液体对于一个固定固体的相对移动。琼脂是电渗是指在电场中液体对于一个固定固体的相对移动。琼脂是一种酸性物质，在碱性溶液中带负电荷，而与它接触的溶液带正