第二章色谱法导论

1、概述概述色谱分离方程色谱分离方程色谱流出曲线和有关术语色谱流出曲线和有关术语第二章第二章 色谱色谱分析导论分析导论色谱分析的基本理论色谱分析的基本理论第一节第一节 概述概述 在进行植物绿叶中色素时，采用石油醚进行在进行植物绿叶中色素时，采用石油醚进行淋洗，并将其注入一根装有碳酸钙颗粒的淋洗，并将其注入一根装有碳酸钙颗粒的玻璃管上端，在加入纯净的石油醚进行淋玻璃管上端，在加入纯净的石油醚进行淋洗。洗。 色谱分离法的原理色谱分离法的原理：当混合物随流动相流：当混合物随流动相流经色谱柱时，就会与固定相发生作用，由经色谱柱时，就会与固定相发生作用，由于各组分在物理化学性质和结构上的差异，于各组分在物理

2、化学性质和结构上的差异，与固定相发生作用的大小、强弱程度不同，与固定相发生作用的大小、强弱程度不同，因此在同一推动力的作用下，不同组分在因此在同一推动力的作用下，不同组分在固定相中的滞留时间不同，从而使混合物固定相中的滞留时间不同，从而使混合物中各组分按一定顺序，先后从色谱柱中流中各组分按一定顺序，先后从色谱柱中流出。出。一、按两相状态分类一、按两相状态分类以气体为流动相的色谱法称为以气体为流动相的色谱法称为气相色谱法气相色谱法。根据。根据固定相是固体吸附剂还是固定液，气相色谱又分固定相是固体吸附剂还是固定液，气相色谱又分为为气固色谱法和气液色谱法气固色谱法和气液色谱法。以液体为流动相的。以液

3、体为流动相的色谱法称为色谱法称为液相色谱法液相色谱法。同理又分为。同理又分为液固色谱法液固色谱法和液液色谱法和液液色谱法。流动相为超临界流体的色谱分析法称为超临界流流动相为超临界流体的色谱分析法称为超临界流体色谱。体色谱。通过化学反应，将固定液键合到载体表面，这种通过化学反应，将固定液键合到载体表面，这种化学键合固定相的色谱称为化学键合相色谱。化学键合固定相的色谱称为化学键合相色谱。二、按固定相的外形及性质分类二、按固定相的外形及性质分类柱色谱法：柱色谱法：填充柱色谱和固定相附着或键填充柱色谱和固定相附着或键合在管内壁上的空心毛细管柱色谱。合在管内壁上的空心毛细管柱色谱。平板色谱法平板色谱法：

4、薄层色谱：薄层色谱纸色谱法纸色谱法三、按分离原理分类三、按分离原理分类利用固体固定相表面对样品中各组分吸附能力强利用固体固定相表面对样品中各组分吸附能力强弱的差异而进行的分离方法称为弱的差异而进行的分离方法称为吸附色谱法。吸附色谱法。利用组分在固定相和流动间分配系数不同而进行利用组分在固定相和流动间分配系数不同而进行分离分析的色谱法称为分离分析的色谱法称为分配色谱法分配色谱法。利用离子交换剂（固定相）对各组分的亲和力的利用离子交换剂（固定相）对各组分的亲和力的不同而进行分离的色谱法称为不同而进行分离的色谱法称为离子交换色谱离子交换色谱。利用大小不同的分子在多孔固定相中的选择渗透利用大小不同的分

5、子在多孔固定相中的选择渗透而进行分离的方法称为而进行分离的方法称为凝胶色谱法或尺寸排阻色凝胶色谱法或尺寸排阻色谱法谱法。 固定相为亲脂性凝胶，流动相为有机溶剂固定相为亲脂性凝胶，流动相为有机溶剂的色谱称为的色谱称为凝胶渗透色谱法凝胶渗透色谱法。 固定相为亲水性凝胶，流动相为水溶液的固定相为亲水性凝胶，流动相为水溶液的色谱称为色谱称为凝胶过滤色谱凝胶过滤色谱。第二节第二节 色谱流出曲线和有关术语色谱流出曲线和有关术语2 2、基本术语、基本术语1 1、基线、基线 无试样通过检测器时，检测到的信号即为基线。无试样通过检测器时，检测到的信号即为基线。2 2、色谱峰、色谱峰1 1）峰高）峰高2 2） 区

6、域宽度区域宽度用来衡量色谱峰宽度的参数，有三种表示方法：用来衡量色谱峰宽度的参数，有三种表示方法：（1 1）标准偏差）标准偏差( ( ) )： 即即0.6070.607倍峰高处色谱峰宽度的一半。倍峰高处色谱峰宽度的一半。（2 2）半峰宽）半峰宽( (W1/21/2) )： 色谱峰高一半处的宽度色谱峰高一半处的宽度 W W1/21/2 =2.354 =2.354 （3 3）峰底宽）峰底宽( (W Wb b) )： W Wb b=4=4 = = 1.699 Y1.699 Y1/21/2某色谱峰，其峰高某色谱峰，其峰高0.6070.607倍处色谱峰宽度倍处色谱峰宽度为为4mm4mm，半峰宽为（，半峰

7、宽为（ ）。）。A.A. 4.71mm B. 6.66mm 4.71mm B. 6.66mm C. 9.42mm D. 3.33mmC. 9.42mm D. 3.33mm3 3）峰面积）峰面积A=1.065hW1/23 3、保留值、保留值v保留值是组分在色谱柱中滞留时间的数值，保留值是组分在色谱柱中滞留时间的数值，或在柱中滞留时间内所消耗的流动相体积。或在柱中滞留时间内所消耗的流动相体积。v可作为定性分析的参数可作为定性分析的参数1 1）死时间）死时间t tM、死体积、死体积V VM M 不被固定相滞留的组分，从进样到出现峰不被固定相滞留的组分，从进样到出现峰最大值所需的时间称为最大值所需的时

8、间称为死时间死时间。=L/t=L/tM M对应死时间所需的流动相称为死体积对应死时间所需的流动相称为死体积V VM MV VM M=t=tM MFcoFco2 2）保留时间）保留时间t tR R、保留体积、保留体积V VR R 组分从进样到出现色谱峰顶点所需的时间组分从进样到出现色谱峰顶点所需的时间称为该组分在柱内的称为该组分在柱内的保留时间保留时间t tR R。组分在柱内的平均线性速率组分在柱内的平均线性速率u uL L为为L/tL/tR R 对应于保留时间所消耗的流动相体积称为对应于保留时间所消耗的流动相体积称为保保留体积留体积V VR RV VR R=t=tR RFcoFco3 3）调整

9、保留时间）调整保留时间t t R R、调整保留体积、调整保留体积V V R R扣除死时间后的保留时间称为调整保留时间扣除死时间后的保留时间称为调整保留时间t t R R = = t tR Rt tM M 调整保留体积（调整保留体积（VRVR）：）： V V R R= V= VR RV VM M4） 相对保留值相对保留值r r2121组分组分2 2与组分与组分1 1调整保留值之比：调整保留值之比： r r2,12,1= t= t R2R2/ /t t R1R1= =V V R2R2/ /V V R1R1 相对保留值只与柱温和固定相性质有关，与相对保留值只与柱温和固定相性质有关，与其他色谱操作条件

10、无关，它表示了固定相对其他色谱操作条件无关，它表示了固定相对这两种组分的选择性。这两种组分的选择性。 在色谱定性分析中，通常选择一个前出峰在色谱定性分析中，通常选择一个前出峰的调整保留值的调整保留值t t RSRS作为基准，然后再求得其作为基准，然后再求得其他后出峰组分他后出峰组分i i对基准峰的相对保留值，此对基准峰的相对保留值，此时用符号时用符号表示。表示。 为选择因子。为选择因子。 = t= t RiRi /t /t RS RS = V= V RiRi /V /V RSRS从色谱峰可以得到以下信息：从色谱峰可以得到以下信息： 根据色谱峰的各种根据色谱峰的各种保留值保留值，可以进行定性，可

11、以进行定性分析分析 根据色谱峰的根据色谱峰的面积、峰高面积、峰高可以进行定量分可以进行定量分析析 根据色谱峰的根据色谱峰的保留值及其区域宽保留值及其区域宽度，可以度，可以评价色谱柱的分离效能以及相邻两色谱峰评价色谱柱的分离效能以及相邻两色谱峰的分离程度的分离程度 根据色谱峰根据色谱峰两峰间的距离两峰间的距离，可以评价固定，可以评价固定相或流动相的选择是否得当相或流动相的选择是否得当 根据色谱峰的根据色谱峰的个数个数，可以判断所含组分的，可以判断所含组分的最少个数。最少个数。第三节第三节 色谱分析的基本理论色谱分析的基本理论 热力学因素热力学因素 动力学因素动力学因素色谱分析的基本理论色谱分析的

12、基本理论塔板理论塔板理论速率理论速率理论一、分配平衡一、分配平衡1 1、分配系数、分配系数K KK K值小的先流出。值小的先流出。2.2. 分配比分配比 在一定温度和压力下，某一组分分配达到在一定温度和压力下，某一组分分配达到平衡时，分配在固定相和流动相中的质量平衡时，分配在固定相和流动相中的质量比比。 组分在固定相中的质量 组分在流动相中的质量k=KVVccVVMVVMMMkmSmsmmSSSSmS 式中式中为相比率。为相比率。 填充柱相比：填充柱相比：6 63535；毛细管柱的相比：毛细管柱的相比：5050150015003 3、保留比、保留比RsRs与分配比与分配比k k的关系的关系 组

13、分在柱内的平均线速度组分在柱内的平均线速度u uL L与相同条件下与相同条件下流动相在该柱内的平均线速率流动相在该柱内的平均线速率u u之比称为保之比称为保留比（滞留比），用留比（滞留比），用RsRs表示表示Rs= uRs= uL L / u=t / u=tM M/t/tR RRs=Rs=组分在流动相中的总质量组分在流动相中的总质量/ /柱内流动相和柱内流动相和固定相中组分的总质量固定相中组分的总质量 =m=mm m/(m/(mm m+m+ms s)=1/(1+k)=1/(1+k)由上两式可得由上两式可得t tR R=t=tM M(1+k)(1+k)k=(tR-tM)/tM= t R/tM=

14、V R/VMt R=tMk=tMKVs/VmtR=tM(1+KVs/Vm)VR=VM(1+KVs/Vm)=VM(1+k)=VM+KVs= t R2/tR1 = V R/VM=k2/k1=K2/K1二、塔板理论二、塔板理论对色谱柱的分离过程作了如下假设：对色谱柱的分离过程作了如下假设： 所有组分开始都进入第零块塔板，组分的所有组分开始都进入第零块塔板，组分的纵向扩散（塔板之间的扩散）可以忽略，纵向扩散（塔板之间的扩散）可以忽略，流动相按前进的方向通过色谱柱流动相按前进的方向通过色谱柱 流动相进入色谱柱是脉冲式的，是不连续流动相进入色谱柱是脉冲式的，是不连续的，每次进入柱中的最小体积为一个塔板的，

15、每次进入柱中的最小体积为一个塔板体积体积V V 在每块塔板上，待测组分在两相间能瞬间在每块塔板上，待测组分在两相间能瞬间达到分配平衡达到分配平衡 分配系数在所有塔板上都是常数，与组分分配系数在所有塔板上都是常数，与组分在塔板中的浓度无关。在塔板中的浓度无关。一、塔板理论一、塔板理论- -柱分离效能指标柱分离效能指标色谱柱长：色谱柱长：L L，虚拟的塔板间距离：虚拟的塔板间距离：H H，色谱柱的理论塔板数：色谱柱的理论塔板数：n n，则三者的关系为：则三者的关系为： n n = = L L / / H H 在色谱分离过程中假设色谱柱是由在色谱分离过程中假设色谱柱是由5 5块塔板组成块塔板组成（n

16、=5n=5），某组分的分配系数），某组分的分配系数k=1k=1，开始加到第零，开始加到第零块塔板质量块塔板质量m=1(1mgm=1(1mg），分配平衡后），分配平衡后m mm m=m=ms s=0.5=0.5。当当1 1V V体积的流动相进入零号塔板时，将流动相体积的流动相进入零号塔板时，将流动相中所含的质量组分中所含的质量组分0.50.5推入到推入到1 1号塔板，此时，零号塔板，此时，零号塔板固定相中的质量组分为号塔板固定相中的质量组分为0.50.5，以及，以及1 1号塔板号塔板中流动相的组分为中流动相的组分为mm=0.5mm=0.5，在各自塔板的两相间，在各自塔板的两相间重新建立分配平衡后

17、，各塔板两项中的组分均为重新建立分配平衡后，各塔板两项中的组分均为0.25.0.25.经经N N次分配平衡后，各塔板上质量的分布遵次分配平衡后，各塔板上质量的分布遵循循（m ms s+m+mm m）N N 塔板模型塔板模型 N=0 1 2 3 4 进样进样 分配分配 平衡平衡 进气进气 分配分配 平衡平衡1.000流动相流动相固定相固定相0.500(mL)流动相流动相0.500(mG)固定相固定相0.500流动相流动相0.500固定相固定相0.2500.250流动相流动相0.2500.250固定相固定相N=0N=1mL=1.000mg0.2500.250流动相流动相0.2500.250固定相固

18、定相0.1250.2500.125mG0.1250.2500.125mL0.1250.2500.1250.1250.2500.1250.0630.1880.1880.0630.0630.1880.1880.0630.0630.1880.1880.0630.0630.1880.1880.0630.03150.1250.1880.1250.03150.03150.1250.1880.1250.0315N=2N=3N=40.0315 0.125 0.188 0.1250.03150.0315 0.1250.188 0.125 0.0315N=50.0160.0780.157 0.157 0.0780

19、.0160.0160.0780.157 0.157 0.0780.016 如果色谱柱的塔板数如果色谱柱的塔板数n n大于大于5050，组分在柱内就可，组分在柱内就可得到多次的平衡分配，如果以组分流出色谱柱的得到多次的平衡分配，如果以组分流出色谱柱的浓度或量为纵坐标对应于的流出时间作出，所得浓度或量为纵坐标对应于的流出时间作出，所得到的流出曲线趋于正态分布。到的流出曲线趋于正态分布。三、速率理论三、速率理论塔板理论不能解释塔板理论不能解释 造成谱带扩张的原因造成谱带扩张的原因 影响柱效的各种因素影响柱效的各种因素 为什么不同流速下测得的塔板数不一样。为什么不同流速下测得的塔板数不一样。速率方程（

20、也称范速率方程（也称范. .弟姆特方程式）弟姆特方程式）: : H H = = A A + + B B/ /u u + + C Cu u H H：理论塔板高度，：理论塔板高度，u u：流动相的平均线速度：流动相的平均线速度( (cm/s)cm/s)，减小，减小A A、B B、C C三项可提高柱效；三项可提高柱效； 存在着最佳流速存在着最佳流速 A A、B B、C C三项各与哪些因素有关？三项各与哪些因素有关？1. 1. 涡流扩散项涡流扩散项A A A A = 2 = 2ddp p d dp p：固定相的平均颗粒直径固定相的平均颗粒直径：固定相的填充不均匀因子固定相的填充不均匀因子 固定相颗粒越

21、小固定相颗粒越小d dp p，填充的越均匀，填充的越均匀，A A，H H，柱效，柱效n n。表现在涡流扩散所引起的色谱峰变宽。表现在涡流扩散所引起的色谱峰变宽现象减轻，色谱峰较窄。现象减轻，色谱峰较窄。2.2. 分子扩散项分子扩散项- - B B B B = 2= 2DgDg ：弯曲因子，填充柱色谱，：弯曲因子，填充柱色谱，11。D Dg g：试样组分分子在气相中的扩散系数（：试样组分分子在气相中的扩散系数（cmcm2 2s s-1-1）。）。由于柱中存在着浓度差，产生纵向扩散由于柱中存在着浓度差，产生纵向扩散3 3、传质阻力项、传质阻力项 C C传质阻力系数传质阻力系数C C由流动相传质阻力

22、由流动相传质阻力CmCm和固定相传质阻力和固定相传质阻力CsCs两项组成。两项组成。 固定相液膜越薄，固定相液膜越薄，扩散系数越大，扩散系数越大，固定相传质阻力固定相传质阻力就越小。就越小。4 4、流动相线速率对板高的影响、流动相线速率对板高的影响涡流扩散相为常数，与流动线速率无关涡流扩散相为常数，与流动线速率无关在低速流区，纵向扩散相在低速流区，纵向扩散相成为影响柱效的主要因素成为影响柱效的主要因素在高速流区，传质阻力项是影响柱效的主要因素。在高速流区，传质阻力项是影响柱效的主要因素。5、液相色谱的范第姆特方程、液相色谱的范第姆特方程液相色谱中，纵向扩散相很小可以忽略不计。液相色谱中，纵向扩散相很小可以忽略不计。第四节第四节 色谱分离方程色谱分离方程一、色谱柱的总分离效能一、色谱柱的总分离效能R R =1.0=1.0：分离程度：分离程度98%98%；R R =1.5=1.5：达：达99.7%99.7