中药丹参酮对复合痴呆大鼠海马内诱导型一氧化氮合酶和乙酰胆碱酯

1、中药丹参酮对复合痴呆大鼠海马内诱导型一氧化氮合酶和乙酰胆碱酯         【摘要】 目的探讨丹参酮对D-半乳糖- A1-40致复合痴呆模型大鼠海马内诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）和乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase，AChE）表达的影响。方法 实验动物随机分成3组：AD模型组：采用1.25% D-半乳糖腹腔注射致衰        【摘要】 

2、 目的探讨丹参酮对D-半乳糖- A1-40致复合痴呆模型大鼠海马内诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）和乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase，AChE）表达的影响。方法 实验动物随机分成3组：AD模型组：采用1.25% D-半乳糖腹腔注射致衰老结合双侧海马齿状回背侧微量注射凝聚态A1-40复合造模方法，拟建立AD样学习记忆功能障碍的痴呆动物模型；丹参酮治疗组：AD大鼠造模24 h后给予丹参酮50 mg/(kg·d)；溶媒对照组：与AD大鼠同法注射等量生理盐水。 采用免疫组织化学和酶组织化学方法，分别观察大鼠海

3、马内iNOS和AChE表达的变化。结果模型组AChE阳性纤维受损，光密度下降（含阳性面积百分比和光密度）；iNOS-ir细胞数显著升高，平均光密度增强；与对照组比较差异极显著（P0.01）。丹参酮处理后，iNOS-ir细胞数明显减少，光密度也下降；AChE阳性神经纤维密度增强；与模型组比较差异有显著性意义（P0.01）。结论丹参酮改善D-半乳糖- A1-40致复合痴呆大鼠学习记忆障碍的作用机制，可能与保护脑内胆碱能神经，以及降低海马内iNOS的表达有关。 【关键词】  丹参酮； D-半乳糖-淀粉样肽蛋白诱导型一氧化氮合酶 乙酰胆碱酯酶大鼠Abstract：ObjectiveTo in

4、vestigate the effect of tanshinone on levels of iNOS and AChE in hippocampus of dementia model rats induced by D-galactose combination with A1-40.MethodsThe experimental animals were randomly divided into three groups. In AD model group 1.25%D-galactose in combination with microinjection of 10 g inc

5、ubated amyloid -peptide  1-40 (A1-40) into the dorsal blade of the dentale gyrus in the hippocampus of rat. In tanshinone therapeutic group,after establishment of rat AD model for 24 h , tanshinone50 mg/(kg·d)was given for 14 days by gastric perfusion. In solvent control group,the rats wer

6、e treated with the same method as AD rats but received injection of the same physiological saline. The expression of iNOS and AChE in rat hippocampus were respectively observed by immunohistochemical and histochemical  methods .Results AChE positive nervous fibers, optical density of AChE

7、positive nervous fibers of AD rats in the hippocampus were  decreased.iNOS-ir cells count and the average optical density of AD rats in the hippocampus were significantly increased as compared with solvent control group. After tanshinone treatment, iNOS -ir cell count and the optical density we

8、re obviously decreased, optical density of AChE-positive nervous fibers were significantly increased as compared with AD model group.ConclusionMechanism of tanshinone to improve learning and memory impairment in dementia model rats induced by D-galactose in combination with A1-40 might be related to

9、 protection of cholinergic nerves in brain and decrease of iNOS expression in hippocampus .Key words：Tanshinone;  D-galactose;  -amyloid peptide protein (A);  Inducible nitric oxide synthase（iNOS）；  Acetylcholinesterase（AChE） ;  Rats     老人常见的痴呆病因是阿尔茨海默病（Alzhe

10、imers disease, AD）1，而AD的病因、发病机制尚未完全清楚。AD患者大脑内主要变化的神经递质是乙酰胆碱（acetylcholine ，ACh），一氧化氮（nitric oxide, NO）及诱导型一氧化氮合酶（inductive nitric oxide synthase, iNOS）24 。有报道，丹参酮A和B能减少小鼠短暂的（急性）局灶性脑缺血的脑梗死灶体积，并可能有神经保护作用5，还能改善缺血再灌注损伤小鼠和东莨菪碱（抗胆碱药）诱发的空间行为缺陷小鼠的学习、记忆障碍6。但就丹参酮对D-半乳糖- A1-40诱发复合痴呆（记忆障碍）病变大鼠的作用未见报道。因此，本研究采用腹腔

11、注射1.25%D-半乳糖致衰老加双侧海马微量注射凝聚态A1-40诱发AD样复合痴呆（记忆障碍）大鼠模型，以观察海马内ACh的降解酶乙酰胆碱酯酶（acetyl cholinesterase, AChE）和iNOS表达的变化，同时观察丹参酮改善大鼠学习记忆的神经化学机制。1  材料1.1  动物选用清洁二级spraque-Dawley(SD)雄性大鼠共45只，体质量250 g左右（华中科技大学同济医学院实验动物学部提供）。实验动物随机分成3组：AD模型组15只;丹参酮治疗组20只；溶媒对照组10只。1.2  试剂及仪器丹参酮（华中科技大学同济医学院临床药理学教研室惠赠

12、），A1-40、DAB（Sigma公司，美国），iNOS多克隆兔抗鼠抗体（Santa Cruz公司），生物素标记羊抗兔IgG工作液、辣根酶标记链霉卵白素（S-A/HRP）工作液（北京中山生物有限公司）。江湾型脑立体定位仪（上海川沙花木农机厂），Y-型水迷宫（中国医学科学院药物所研制），AO恒冷箱切片机（美国AO公司），HPIAS-1000彩色病理图文分析系统（华中科技大学同济医学院清屏影像工程公司组装）。2  方法2.1  造模方法全部大鼠在实验前应用水迷宫试验进行学习记忆功能的检测，选取学习记忆功能正常的大鼠随机配组实验；每组动物造模完成后，分别采用水迷宫试验鉴定动物模型

13、。2.1.1  动物学习记忆功能的测试采用Y-型水迷宫试验监测大鼠学习记忆功能。记录大鼠平均逃避潜伏期（从入水起点至寻找到阶梯出水的时间）和进入盲端的错误次数（逃避错误频率，次/3min）。预训练4 d，2次/d，每次训练时间定为3 min，3 min仍未找到安全通道者以180s计算。训练第1天让大鼠自由游泳，第24天训练时，试验者可引导大鼠进入安全通道。    按照Zealonga 5级评分法，在造模大鼠清醒后，立即进行动物神经功能的评定。评分标准为：正常（0分）；对侧肢体屈曲（1分）；拖鼠尾后拉时，对侧肢体无力（2分）；拖鼠尾后拉时，向对侧转圈（3分

14、）；自发向对侧转圈或倾倒（4分）。选取评分为2分及以上造模大鼠入围实验。2.1.2  D-半乳糖腹腔注射参照文献7，8以无菌生理盐水配制1.25% D-半乳糖溶液。AD模型组和丹参酮治疗组按50 mg·kg-1·d-1的标准计算相应的D-半乳糖盐液量，腹腔注射，连续6 周。溶媒对照组大鼠与AD模型组同法腹腔注射等量的生理盐水。2.1.3  A1-40海马注射在D-半乳糖连续处理6周后的第2天，施行A1-40海马注射。即：大鼠腹腔注射10 %水合氯醛（0.35 g/kg）麻醉，头顶部去毛，消毒皮肤并切开1.5 cm长切口，暴露颅骨和前囱。用牙科钻头钻开颅骨

15、，在海马齿状回背侧（参照大鼠脑立体定位图谱，定位坐标为前囟后3.5 mm，脑正中线旁开2.0 mm，深度2.7 mm）缓慢注入A1-40各1 l（10 g A1-40溶于1 l无菌生理盐水，用前37下孵育1周，使其凝聚老化）。注射完毕后留针5 min（保证溶液充分扩散），然后缓慢起针。蜡封闭针孔，撒消炎粉止血消炎，缝合皮肤。溶媒对照组大鼠与AD模型组同法，于海马区注射等量的生理盐水1 l。术后将大鼠放回鼠笼中常规饲养。并肌注青霉素抗感染（40万u/d·只，连续7 d）。丹参酮治疗组在D-半乳糖-A1-40复合造模后24 h给予丹参酮9，丹参酮均按50 mg·kg-1

16、3;d-1溶于5 ml玉米油中灌胃。溶媒对照组及AD模型组仅以等量玉米油灌胃。各连续14 d。2.2  染色方法实验大鼠以10%水合氯醛腹腔麻醉，经左心室升主动脉灌注温的生理盐水100 ml，随即快注冷的4%多聚甲醛固定液（4，pH7.3）100 ml，然后慢速灌注多聚甲醛液250 ml。开颅取脑，依次入20%、30%蔗糖磷酸缓冲液（PB，0.1 mol/L，pH7.4）中浸透，制作海马冠状恒冷箱连续切片，片厚25 m，PB接片，收集全部切片，做形态学各项指标检测。2.2.1  AChE组织化学法部分切片入改良的karnovsky-Roots孵育液，37孵育2h，以0.05 mol/L Tris-HCI缓冲液（pH7.6）漂洗切片，DAB/H2O2-硫酸镍铵染色液显色。阳性神经纤维呈灰蓝色。2.2.2  iNOS免疫活性的表达（SP法）部分切片用0.25%triton X-100，37预处理30 min。转入正常小牛血清室温20 min（封闭非特异抗原）。切片先后入一抗（iNOS，1100）4孵育72 h，二抗室温30 min，SP复合物