氯化高铁血红素对正常及再生障碍性贫血小鼠红系祖细胞的体内诱导

1、    氯化高铁血红素对正常及再生障碍性贫血小鼠红系祖细胞的体内诱导作用        摘要目的：研究氯化高铁血红素(Hm)对正常及再生障碍性贫血(再障)小鼠红系祖细胞(BFU-E和CFU-E)的体内诱导作用。方法：分不同剂量诱导组(0.65，6.50，13.00g/g体重，诱导时间为静脉注射后6小时)及不同时间诱导组(注射后6，12及24小时，Hm剂量为6.50g/g体重)，采用甲基纤维素体系进行红系祖细胞培养。结果：再障小鼠骨髓BFU-E数量(3±2个/股骨)及

2、CFU-E数量(12±3个/股骨)与正常小鼠相比均明显减少BFU-E为1?056±160个/股骨，P<0.01;CFU-E为12±3个/5个高倍视野(×200)。6.50g/g体重Hm诱导后6小时，再障小鼠BFU-E数量增加到10±2个/股骨，CFU-E增加到39±12个/股骨，与对照组再障小鼠相比，均有显著差异(P<0.01)。经诱导后的正常小鼠骨髓BFU-E增加到3?410±708个/股骨，CFU-E数量增加到38±3个/5个高倍视野，与对照组正常小鼠相比，有显著差异(P<0.01)。Hm体内

3、诱导的最适剂量为6.50g/g体重，最适诱导时间为静脉注射后6小时。结论：Hm是一种体内红系细胞分化诱导剂，对再障小鼠红系祖细胞亦有诱导作用。关键词氯化血红素小鼠贫血,再生障碍性红系祖细胞 In vivo inductive effect of hemin on the erythroid progenitor of the normal and aplastic anemia miceWang Chuanqing, Yuan Miman. Department of Hematology, Zhongshan Hospital, Shanghai Medical University. Sh

4、anghai200032AbstractObjective:To investigate the in vivo effect of hemin on erythroid progenitor of the normal and aplastic anemia mice. Methods：BFU-E and CFU-E of normal and aplastic anemia(AA) mice were assayed at different time (6h, 12h and 24h) after hemin injection on a dosage of 6.50g/g body w

5、eight, and at 6h after injection of different doses of hemin (0.65g/g, 6.50g/g and 13.00g/g body weight). Results: The yields of BFU-E and CFU-E from AA mice were reduced compared with that from normal mice. At 6h after hemin injection (6.50g/g b.w.), the yields of BFU-E and CFU-E from AA mice were

6、increased from 3±2/femur and 12±3/femur to 10±2/femur (P<0.01) and 39±12/femur (P<0.01), respectively, and so did the case for normal mice (for BFU-E, from 1?056±160/femur to 3?410±708/femur,P<0.01, and for CFU-E, from 12±3/five 200×fields to 38±

7、3/five 200× fields, P<0.01). Low dose of hemin had no inductive effect. Conclusion: Hemin is a in vivo inducer of erythroid progenitors both in normal and AA mice. Key WordsHeminMiceAnemia,aplasticErythroid progenitor cells再生障碍性贫血(再障)发病机制复杂、治疗困难已为众所周知，虽近年来有人主张用大剂量的Epo治疗，但疗效不甚理想，且价格昂贵也限制其使用。因

8、此，有必要寻找治疗再障的新途径。氯化高铁血红素(Hm)是一种红系特异性分化诱导剂。已有研究表明，Hm体内诱导增加小鼠红系祖细胞集落(BFU-E)的数量1，促进红系造血，但Hm在再障中的诱导作用尚不清楚。为此，我们通过建立免疫活性细胞诱导的小鼠再障模型，来探讨Hm对再障小鼠红系祖细胞体内诱导作用。材料和方法1BALB/c小鼠再障模型依姚军等方法2建立再障小鼠模型。BALB/c及DBA/2小鼠，10周龄，雄性，均由上海医科大学动物部提供。2Hm对正常及再障(第10天)小鼠红系细胞分化的体内诱导5mmol/L Hm溶液的配制：将32.5mg Hm(Sigma产品)溶于0.25ml 1mol/L KO

9、H溶液中。加蒸馏水8ml，1mol/L HCl调pH值至7.27.4，加蒸馏水至总体积为10ml，0.2m滤膜过滤除菌，分装后置-20保存。将正常及再障小鼠随机分为不同剂量诱导组及不同时间诱导组，每组9只小鼠。前者Hm剂量分别为0.65，6.50，13.00g/g体重，正常对照组及对照再障小鼠注射生理盐水，诱导剂均由尾静脉注射，诱导时间为6小时。后者Hm诱导剂量为6.50g/g体重，分别于体内注射后6，12及24小时进行骨髓红系祖细胞培养。当Hm剂量超过13.00g/g体重时小鼠出现铁中毒死亡。3小鼠骨髓细胞悬液的制备颈椎脱臼法杀死小鼠后将其浸入70%乙醇中，片刻后取出，无菌操作下剪掉后肢，取

10、出股骨，剪去股骨两端，用1ml DMEM培养液冲洗骨髓腔并反复吹打，细胞悬液以1?000r/min离心10分钟，共离心2次，台盼蓝染色进行活细胞计数。4小鼠骨髓细胞CFU-E及BFU-E培养甲基纤维素培养体系1：0.8%甲基纤维素-DMEM培养液，30%小牛血清，1%BSA-(Sigma产品)，10-4mol/L 2-巯基乙醇(Sigma产品)，rhEpo在BFU-E培养时浓度为4U/ml，CFU-E培养时为1U/ml，细胞浓度为5×105/ml。培养条件同悬浮培养。培养2天后计数每5个高倍视野(×200)联苯胺阳性CFU-E数量，培养的第7天计数50个细胞以上的桔红色BF

11、U-E集落。5统计分析两样本均数比较用t检验，多个样本均数比较检验采用完全随机方差分析。结果1Hm对正常小鼠骨髓BFU-E、CFU-E的诱导作用1.1不同剂量诱导组小鼠骨髓BFU-E、CFU-E的改变：低剂量Hm(0.65g/g体重)对小鼠BFU-E无诱导作用(980±153个/股骨，正常对照组为1?056±160个/股骨)，但可提高CFU-E数量(23±3个/5个高倍视野，正常对照组为12±3个/5个高倍视野，P<0.05)；增加Hm诱导剂量(6.50g/g体重)，BFU-E(3?410±708个/股骨)及CFU-E(38±3

12、个/5个高倍视野)数均明显提高，与正常对照组相比，P<0.01；当剂量增加到13.00g/g体重时，BFU-E(2?837±216个/股骨)及CFU-E(23±7个/5个高倍视野)数量虽然仍高于正常对照组(P<0.01)，但已开始减少。1.2不同诱导时间BFU-E数量的变化：经尾静脉注射Hm后6小时，BFU-E数量提高最明显(3?410±708个/股骨)，与正常对照组(1?056±160个/股骨)相比，P<0.01；12小时后诱导作用开始减弱(1?509±279个/股骨)，24小时后BFU-E数量恢复到诱导前水平(964

13、77;183个/股骨)。2Hm对再障小鼠红系祖细胞的体内诱导作用2.1再障小鼠与正常小鼠骨髓BFU-E数量的比较：再障小鼠骨髓BFU-E数量(3±2个/股骨)比正常小鼠(1?056±160个/股骨)明显减少(P<0.01)。集落细胞组成亦少。2.2Hm对再障小鼠骨髓BFU-E、CFU-E的诱导分化：低剂量Hm(0.65g/g体重)对再障小鼠BFU-E(3±1个/股骨)及CFU-E数量(11±3个/股骨)无诱导作用(对照再障小鼠分别为3±2个/股骨，12±3个/股骨，P>0.05)。当Hm剂量为6.50g/g体重时，BFU-

14、E(10±2个/股骨)及CFU-E(39±12个/股骨)数目均明显提高(与对照再障小鼠相比，P<0.01)。当剂量增加到13.00g/g体重时，BFU-E(10±2个/股骨)及CFU-E(28±3个/股骨)数量虽仍高于对照再障小鼠(P<0.01)，但已开始减少。经尾静脉注射Hm后6小时，BFU-E数量提高最明显(10±2个/股骨)，与对照再障小鼠(3±2个/股骨)相比，P<0.01；12小时后诱导作用开始减弱(7±2个/股骨)；24小时后，BFU-E数量下降到5±1个/股骨。讨论目前大多数学者采用

15、细胞株来研究Hm的诱导作用，为更全面了解Hm的体内诱导作用，我们给小鼠体内注射了不同剂量的Hm，并在体内注射后不同时间内观察骨髓红系祖细胞数量的变化，结果高剂量Hm均使正常及再障小鼠CFU-E、BFU-E数量有不同程度的增加，低剂量Hm对再障小鼠BFU-E、CFU-E无作用，但可提高正常小鼠骨髓CFU-E。Hm体内诱导的最适剂量为6.50g/g体重，Hm体内作用高峰时间为静脉注射后6小时。有报道，Hm对CFU-S无诱导作用1，这一结果说明，小鼠骨髓BFU-E数量的增加不是CFU-S数量增加所致。Hm在体内与血液结合素结合后很快被肝脏摄取而降解3，而Hm对BFU-E的诱导作用可持续12个小时，提

16、示内源性Hm带入培养体系的可能性不大。Hm体内诱导剂量为体外诱导剂量的1/201，说明即使内源性Hm带入培养体系，也不可能对细胞分化产生影响。以上分析说明，红系克隆的增加是Hm体内诱导的结果。推测Hm在短时间内增加红系祖细胞BFU-E、CFU-E的数量可能是红系祖细胞自身增殖与其前体细胞定向分化的共同结果。Monette等1在小鼠处死前1小时，给小鼠静脉注射羟基脲，结果Hm诱导的骨髓BFU-E数量减少了72%±13%，提示Hm诱导后，处于S期的BFU-E数量增加。有实验证实，K562细胞在Hm诱导后，可引起c-myb基因表达，c-myb基因表达能使细胞从G1期向S期转化4，5。因此，

17、Hm诱导的BFU-E的增加可能与诱导c-myb基因表达有关。再障患者血清Epo水平明显高于正常水平，但仍不能促进造血，除了与造血祖细胞减少有关外，有人认为也可能与红系祖细胞Epo受体减少或Epo受体对Epo的敏感性降低有关6。已有实验证实，Hm能增加HEL细胞及MEL细胞Epo受体表达4。因此，Hm促进再障小鼠红系祖细胞分化是否与其增加红系祖细胞Epo受体的表达有关将有待于研究。参 考 文 献1Monette FC，Holden SA，Sheehy MJ, et al. Specificity of hemin action in vivo at early stages of hematop

18、oietic cell differentiation. Exp Hematol， 1989, 12:782-787.2姚军，李树浓. 免疫诱导小鼠再障模型的建立. 中山医科大学学报， 1991， 11:封四.3Smith A,Morgan WT.Hemopexin-mediated transport of heme into isolated rat hepatocytes.J Biol Chem,1981,256:10902-10909.4Abraham NG.Molecular regulation-biological role of heme in hematopoiesis.Blood Rev，1991,5:19-28.5Kamano H，Tanaka T，Ohnishi H, et alEffect of the antisense myb expression on hemin and erythropoietin-induced erythroid d