完整word版,Westernblot一、实验目的western技术是用来检测蛋白表达的特定的

1、Western blot实验目的western技术是用来检测蛋白表达的特定的灵敏的方法。原理与Southern或Northern杂交方法类似，但 Western Blot采用的是聚丙烯酰胺 凝胶电泳，被检测物是蛋白质，探针”是抗体，显色”用标记的二抗。经过PAGE 分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以 非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。 以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或 同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的 特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测

2、蛋白水平的表达。三、操作步骤（一）样品处理1 培养的细胞： 去培养液后用温的PBS冲洗23遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。 加入适量的冰预冷的裂解液后置于冰上1020min。 用细胞刮刮下细胞，收集在EP 管后超声（100200w） 3s， 2次。 12000g 离心， 4， 2min 。 取少量上清进行定量。 将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀后加 loading buffer 后直接上样最好，剩余溶液（溶于IXoading buffer）可以低温储存，-70C 一个月，-20C一周，4c 12天，每次上样前98， 3min。或收取细胞于EP管中加入适量的1XSDS,吹匀，100度5m

3、in,重复一次。1200rpm ,10min. 取上清定量。3组织： 匀浆 对于心肝脾肾等组织可每 50100mg力口 1ml裂解液，肺100200mg加1ml裂解液。可手动或电动匀浆。注意尽量保持低温，快速匀浆。 12000g 离心， 4， 2min 。 取少量上清进行定量。 将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀加 loading buffer 后直接上样最好，剩余溶液（溶于1Moading buffer）可以低温储存，-70C 一个月，-20C一周，4c 12天，每次上样前98， 3min 。由于蛋白酶抑制剂可影响蛋白定量，且新鲜蛋白很少降解，故可不加，如加按建议比例即可。提取磷酸化的蛋

4、白还需加Na3VO4 0.1mM 及 NaF 25mM）。1 loading buffer 配方：10% 甘油，50mM Tris Cl （pH6.8）, 2% &琉基乙醇，0.20.5 %澳酚蓝，2%或5%的SDS。Buffer可配成2段5X,注意SDS终浓度勿超过10%。对于心脏，肌肉等碎屑较多的组织可用5%的SDS,肝肾等组织2%即可。）（二）配胶1 .注意一定要将玻璃板洗净，最后用ddH2O冲洗，将与胶接触的一面向下倾斜置于干净的纸巾晾干。分离胶及浓缩胶均可事先配好 （除 AP 及 TEMED 外） ， 过滤后作为储存液避光存放于 4，可至少存放1 个月，临用前取出室温平衡加入

5、10%AP 及 TEMED.2 . 封胶：灌入2/3的分离胶后应立即封胶，胶浓度 10%时可用0.1%的SDS封，浓度10%时用水饱和的异丁醇或异戊醇，也可以用0.1%的SDS。封胶后切记，勿动。本实验室一般用水或异丙醇封胶。待胶凝后将封胶液倒掉，如用醇封胶需用大量清水及ddH2O 冲洗干净，然后加少量0.1%的SDS,目的是通过降低张力消除残留水滴。片刻后倒掉SDS,将玻璃板倒立放置片刻控净。3 .封好浓缩胶后1h 拔除梳子， 注意在拔除梳子时宜边加水边拔， 以免有气泡进入梳孔使梳孔变形。拨出梳子后用 ddH2O 冲洗胶孔两遍以去除残胶即可上样，长时间有利于胶结构的形成，因为肉眼观的胶凝时其

6、内部分子的排列尚未完成。（10%的 AP 最好现配现用，如在4存放勿超过两周。30%的丙烯酰胺如有沉淀，最好弃掉 .）各种分离胶各种组份名称各种凝胶体积所对演的耳冲州价的取样显5ml10ml15ml201111h3o2 65 37 9LC(5»Aciylan'JcU1j41 5MTns-Hl(pHS.S)132.S5.S5.0LD%SDS0.050 10C.150.2010% AP0950 10D.150.20TEMED0 0040 00300120 016网bGHH;O2.34 65993NVAry 履 id 他132.745 1L 5V Tn!?-H4?l(pH S.fi

7、)132.53 a5 010%SDSDO?0 ICr： i>0 201OHAP0950 10(J50.20TEMED0.0030.0 360 0090 012IGoGelII：O194.C597.9?Q? oAfiylaiinde1.756.1MM Tn-Hcl(pH SIT295.35 0lOSDS0.C50.100 15O.2D109 aAP0.05O.LO0.15OJDIEMED0.0020.0g0.0050.C0&12*oCelH2Q1.6& 34.96630° aAcivlannde246S15y Tns*EIcl(pH 3.3：1.31 3.35.0

8、IC%SDS0.050.100 1：0.201O?AP0 0?0.100.150.20IEMED0.0020.0C40.006o.cos154oGelHX)1.12.33.4460,J aAci vlanncV2.55(l"510.015M Tm-Hcl(pH 8.3l.i7.53.8s 010&DS0,050.100 150.2010HAP0.05O.LD0.150.2 DTEMFD0 002O M4a砌5fi.GCS5唏液解腹一种州份弘称各种涉丽和麻村应的价的取样力lid2ndSulllull5nil611JSull1 OuJH：00.681.402 in2*03 404

9、.105,506月CoAciAi amide0A703；0 500.6"083LOO130171 SM TiU-Hel(pH 8 £)0.130.2SOSS0 5006>0151.001.250.010.020 50380050.060,080 1010% AP0.01OS0 03。一帖005M6OGE。TFNIED0.001OH也0 0030 005o oor>fi.fmsCi GIO(三)电泳1 .上样前将胶板下的气泡赶走。2 .在需要的地方加入marker (Fermentas)3ul所有蛋白样品调至等浓度后上样或上等量的蛋白，样品两侧的泳道用等体积的 1

10、 loading bufer上样，Marker也用1 loading buffer调整至与样品等体积。3 .以初始电压为100V强度进行电泳，当marker分开后换用150V至距胶下缘1cm 以上结束。（四）转膜万口5用抗转印槽的锁闭凝胶支架转印夹系统。转印夹 支撑制胶 印迹膜（3两侧有纤维 衬熟和谍氏H）确保凝胶三明治内的完全接触。凝胶夹垂直插入线冲液槽中C5） 01 .电泳结束前10 min戴上手套开始准备：浸泡NC膜：将NC膜平铺于去离子水面，靠毛细作用自然吸水后再完全浸入水中 10min以排除气泡，随后浸泡入转移液中。PVDF膜则在M-OH中浸泡20min以上后 转入转移液中。将滤纸也

11、浸入转移液中。2 .取胶：将胶卸下，保留30-100KD或分子量范围更广些的胶（以便以后杂其他感兴趣的蛋 白），左上切角，在转移液中稍稍浸泡一下，置于洁净玻璃板上，按顺序铺上膜与每 侧一张（干转每侧三张）滤纸。注意用玻棒逐出气泡，剪去滤纸与膜的过多部分（尤 其是干转，以防止短路）3 .转股： 湿转：电转槽用去离子水淋洗晾干，加入转膜液。将胶平铺于海绵上，滴加少许电转液再次驱赶气泡，封紧后放入电转槽，注意膜在正极一侧。降温，将电泳槽置于冰水混合物中。 100 伏 80min 左右，注意不同蛋白的要求不同。干转：用电转液淋洗石墨电极， 滤纸吸干，铺上胶， 再滴少许电转液，以 1.5mA/cm2凝胶

12、面积转移1-2h。负载电压不宜超过1V/cm2胶面积。（五） 封闭5%脱脂奶，室温1h。（六）免疫反应1 用 TBST 洗膜 >3/5min.2 加入一抗， 4 放置 12hr 以上。3弃一抗，用TBST洗膜M4 加入辣根过氧化物酶偶联的二抗平稳摇动，室温1h。弃二抗，用TBST洗膜 X3/5min.（ 七）显色现常用的有底物化学发光 ECL 和底物 DAB 呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用 HRP 标记） ：反应底物为过氧化物 +鲁米诺，如遇到HRP,即发光，可使胶片曝光，就可洗出

13、条带。本实验室用 FUJI 仪器进行扫描膜（具体见仪器使用说明）四、主要试剂1、烯酰胺和N ， N -亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)内稀酰胺和1%(w/v)N, N'-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺 29g, N, N-亚甲叉双丙稀酰胺1g,加H2O至100ml。)储于棕色瓶，4c避光保存。严格核实 PH 不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。如有沉淀，可以过滤。2、十二烷基硫酸钠 SDS溶液:10%(w/v)0.1gSDS, 1mlH2O去离子水配制，室温保存。3、分离胶缓冲

14、液：1.5mol/LTris-HCL(pH8.8):18.17gTris、水 75ml 再加 HCL 至 pH8.8, 加水稀释到 100ml 终体积。4、 浓缩胶缓冲液: 1mol/LTris-HCL(pH6.8):12.11gTris 溶于 75mlH2O 中， 用 HCL 调至pH6.8加水稀释到100ml终体积。这两种缓冲液必须使用 Tris碱制备，再用HCL 调节 PH 值，而不用 Tris.CL 。5、 TEMED 原溶液：实验室有商品化的可直接用。6、2 SDS 加样缓冲液:pH6.8 0.5mol/L Tris 缓冲液 8ml,甘油 6.4ml, 10%SDS 12.8ml,

15、巯基乙醇 3.2ml， 0.05%溴酚蓝1.6ml ， H2O 32ml 混匀备用。 按 1:1 或 1:2 比例与蛋白质样品混合，在沸水终煮3min混匀后再上样，一般为20-25ul,总蛋白量100小田7、Tris-甘氨酸电泳缓冲液：30.3gTris, 188g甘氨酸，10gSDS,用蒸储水溶解至1000ml, 得 0.25mol/L Tris-1.92mol/L 甘氨酸电极缓冲液。临用前稀释10倍。8、转移缓冲液：配制1L转移缓冲液，需称取2.9g甘氨酸、5.8gTris碱、0.37g SDS, 并加入 200ml 甲醇，加水至总量1L 。或10洋专膜液：Tris碱30.28,甘氨酸15

16、0.14至800ml.9、 丽春红染液储存液：丽春红 S 2g 三氯乙酸 30g 磺基水杨酸30g 加水至 100ml 用时上述储存液稀释10 倍即成丽春红S 使用液。使用后应予以废弃。10、 脱脂奶粉 5%(w/v) 。11、 BST20mmol/LTris/HCL(pH7.5) ， 500mmol/NACL.Tween 按 1： 1000加入。12、过化物酶标记的二抗。五常见问题1. 如何选择最合适的蛋白杂交膜？解答： 蛋白质印迹杂交是分子生物学实验中极为常用的一门技术。 选择质量上层、合乎要求、方便适用的杂交膜是决定这项实验成败的重要环节。根据杂交方案、被转移生物大分子的特性以及分子大小

17、等等因素，我们要量体裁衣，从杂交膜的材质、孔径和规格上都要做出合理的选择。硝酸纤维素膜：硝酸纤维素膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物。在低离子转移缓冲液的环境下， 大多数带负电荷的蛋白质会与硝酸纤维素膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起，虽然这其中的机制还不是十分清楚，但由于硝酸纤维素膜的这个特性，而且易于封闭非特异性结合，从而得到了广泛的应用。在非离子型的去污剂作用下， 结合的蛋白还可以被洗脱下来。 根据被转移的蛋白分子量大小，要选择不同孔径的硝酸纤维素膜。因为随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量蛋白的结合就越牢固。但是膜孔径如果小于0.1mm,蛋白的转移就很难进行了。因止匕，我们通常用0.45

18、小和0.2小两种规格的硝酸纤维素膜。大于20kD的蛋白就 可以用0.45小的膜，小于20kD的蛋白就要用0.2小的膜了，如果用0.45小的 膜就会发生“Blowthro gh现象。从膜的质地上来看，最重要的指标就是单位面 积上能够结合的蛋白的量。 硝酸纤维素膜的结合能力主要与膜的硝酸纤维素的纯度有关，市场上有些硝酸纤维素膜通常会还有大量的醋酸纤维素，因而降低了蛋白的结合量。 S&S 公司采用的是100%纯度的硝酸纤维素，保证了最大的蛋白结合量，可达80-150仙g/cm2由于100%的纯度，因而也大大减少了非特异性的结合，降低杂交背景，无需高严谨度的洗脱步骤。其次，膜的强度和韧性也是需

19、要考虑的因素。 常规的硝酸纤维素膜比较脆， 漂洗一两次就会破损， 不能反复使用。PVDF 转移膜： PVDF 是一种高强度、耐腐蚀的物质，通常是用来制造水管的。PVDF 膜可以结合蛋白质，而且可以分离小片段的蛋白质，最初是将它用于蛋白质的序列测定，因为硝酸纤维素膜在Edman试剂中会降解，所以就寻找了 PDVF作为替代品，虽然PDVF 膜结合蛋白的效率没有硝酸纤维素膜高，但由于它的稳定、耐腐蚀使它成为蛋白测序理想的用品，一直沿用至今。 PVDF 膜与硝酸纤维素膜一样， 可以进行各种染色和化学发光检测， 也有很广的适用范围。 这种 PVDF 膜，灵敏度、分辨率和蛋白亲和力在精细工艺下比常规的膜都要高，非常适合于低分子量蛋白的检测。但PVDF 膜在使用之前必需用纯甲醇进行浸泡饱和 1-5 秒钟。离子交换型转移膜：硝酸纤维素和 PVDF 膜是靠疏水作用结合蛋白的，还有一类膜是根据离子交换的方式结合生物大分子的。由 DEAE （二乙氨乙基）修饰的纤维素制成的 DEAE 阴离子交换膜同样可以 作为蛋白质印迹的固相支持物。 DEAE可以有效的结合阴离子基团，包括那些高于其等电点的蛋白质。在pH10 以下，DEAE 基团都能带电荷，在低离子强度的转移液中结合蛋白分子。其最适的 pH环境为 5-7。 DEAE 膜可以用于蛋白多糖、病毒、酶以及血红蛋白的研究。这种0.45N矶径的DEAE膜