院感细菌培养操作

1、1. 目的 : 医院是病原微生物较集中 , 抵抗力低的人群密集的地方 , 加之化疗、 放疗 等手段的采用，影响病人免疫机能下降，大量使用抗生素，引起耐药菌株增多，菌群失调，以及先进医疗仪器广泛应用等原因，增加消毒灭菌的难度，致使院内感染已成为当前医疗实践的严重障碍，直接影响医疗效果。进一步规范院内感染监测标本的程序，更好、更快检测病原微生物的生长情况，预防医院感染的发生。2. 设备、试剂与材料2.1 VITEK 2 compact 鉴定药敏分析系统2.2 VITEK 32 鉴定药敏分析系统2.3 美国FORMA级生物安全柜2.4 显微镜2.5 酒精灯2.6 接种环2.7 恒温培养箱2.8 各种

2、培养基2.9 革兰氏染色液2.10 触酶试剂2.11 氧化酶试剂2.12 移液器2.13 无菌吸嘴3. 院感标本采集3 1 空气的采样3 1 1 采样时间选择消毒处理后与进行医疗活动之前期间采样。3 1 2 采样高度与地面垂直高度80-150CM。3. 1. 3布点方法室内面积v 30m2,设一条对角线上取三点，即中心一点，两端各距墙1m处各取一点；室内面积30m2,设东、西、南、北、中 5点，其中东、 西、南、北点均距墙1m。5min 后送检。3. 1. 4采样方法 用9cm直径普通营养琼脂平板在采样点暴露3 2 物体表面采样3 2 1 采样时间 选择消毒处理后 4 小时内进行采样。3.2.

3、2采样面积被采表面v 100cnt取全部表面；被采表面100c宿，则取100cn2（3. 2. 3采样方法用5X5 cm2的标准来灭菌规格板，放在被检物体表面，用无菌规格板，放在被检物体表面，用浸有无菌生理盐水采样液的棉拭子 1 支，在规格板内横竖往返各涂抹5 次，并随之转动棉拭子，连续采样1-4 个规格板面积，剪支手接触部位，将棉拭子放入装 10ml 采样液的试管中送检。门把手等小型物体则采用棉拭子直接涂抹物体的方法采样。3 3 医护人员手采样3 3 1 采样时间 在接触病人、从事医疗活动前进行采样。3 3 2 采样面积及方法 被检人五指并拢， 将浸有无菌生理盐水采样液的棉拭子一枝在双手指曲

4、面从指跟到指端来回涂擦各两次（一只手涂擦面积30 cm2） ，并随之转动采样棉拭子，剪去手接触部位，将棉拭子放入装有10ml 采样液的试管内送检。采样面积按平方厘米（cm）计算。3 4 医疗用品采样3 4 1 采样时间在消毒或灭菌处理后，存放有效期内采样。3 4 2 采样方法右用破坏性方法取样的医疗用品，如输液（血）器、注射器和注射针等，取其中的一部分放培养液中培养。对不能用破坏性方法取样的特殊医疗用品，可用浸有无菌生理盐水采样液的棉拭子在被检物体表面涂抹采样，被采表面v 100cm",取全部表面；被采表面）100c宿，取lOOcnt 3 5 使用中消毒剂的采集3 5 1 采样时间

5、采取使用中的消毒剂。3 5 2 采样方法在无菌条件下，用无菌注射器抽取1ml 被检样品，加入10ml稀释液混匀。 (对于醇类与酚类消毒剂稀释液用灭菌生长盐水；对于含氯消毒剂、含碘消毒剂、过氧化物消毒剂，需在灭菌生理盐水中加入0.1%硫代硫酸钠；对于洗必泰、季镂盐类消毒剂，需在灭菌生理盐水中加入3% (w/v)吐温80和0.3%卵磷脂；对于醛类消毒剂，需在灭菌生理盐水中加入0.3%甘氨酸；对于含有表面活性剂的各种消毒剂，需在灭菌生理盐水中加入 3%( w/v )吐温80，以中和被检样液的残效作用。 )3 6 内镜的采样3 6 1 咽喉镜、支纤镜用 10ml 戊二醛中和液冲洗内镜后，送检实验室。3

6、. 6. 2胃镜、消化镜、宫腔镜 用10m10.1%硫代硫酸钠中和液冲洗内镜后，送检实验室。3 6 3 鼻咽镜、过氧化氢消毒的腔镜类用 10m1 生理盐水中和液冲洗内镜后，送检实验室。4 7 透析液的采样用灭菌的空试管取透析液10m1 送检。4. 院感标本的运送及交接签收4 1 标本的采集4 1 1 空气标本的采集由临床科室负责完成，标本采集完毕，由临床各科在规定的时间内将标本安全送回实验室。4 1 2 物体表面、医务人员手、消毒剂、内镜等由院感科负责组织采样，在规定时间内将标本安全送达实验室。4 2 采样后必须尽快对样品进行相应指标的检测，送检时间不得超过6 小时，若样品保存于0-4 条件时

7、，送检时间不得超过24 小时。4 3 标本收回实验室后 , 将标本的信息登记在“院感监测登记本”上。4 4 微生物室工作人员的验收 根据微生物室院感标本拒收标准进行检查，对不符合要求的，将拒收，立即退回给送检人员，指出问题，告知标本重取，所有拒收标本均需在标本拒收记录本上登记。拒收情况如下：4 4 1 空气培养平板数目击者不正确（房间小于 30 平方米做 3 个平板培养，房间大于 30 平方米做 5 个平板培养） 。4 4 2 未注明标本采集科别、来源和培养目的。5 4 3 标本明显受污染。5. 检测步骤 见本文件末面流程图5 1 空气标本的检测6 1 1 细菌室收到标本后，将标本编写当日日期

8、，用平板压住验单，直接放入35 培养箱培养48 小时后，观察结果。5. 1. 2有菌生长，则挑取可疑菌落进行鉴定，排除金黄色葡萄球菌、B溶血链球菌、铜绿假单胞菌等致病微生物的检出。5. 1. 3结果计算及菌落换算空气细菌菌落总数（cfu/m 3） =50000N/AT,式中A平板面积，cm2; T平板暴露时间，min; N 平均菌落数，cfu/平皿。即平皿上 1 个菌落等于空气中菌落数为 157 cfu/m 3 ， 如果标本为 3 个点时换算=平皿上的菌落数X 157+点数。5 2 物体表面样本检测5 2 1 细菌室收到标本后，将标本编号，振摇80 次后，吸 500ul 于普通琼脂平板中，把平

9、板摇均匀，放入35培养箱培养48 小时后，观察结果。5. 2. 2有菌生长，则挑取可疑菌落进行鉴定，排除金黄色葡萄球菌、B溶血链球菌、铜绿假单胞菌等致病微生物的检出，如为儿科、爱婴区、新生儿科、儿科 ICU的标本时，还要排除沙门氏菌的检出。5 2 3 结果计算及菌落换算 物体表面细菌菌落总数( cfu/c m 2) =平皿上菌落数X采样液稀释倍数(A) /采样面积(cm2)。采样液稀释倍数即是采集液总量与接种的采集液量之比值， 即平皿上 1 个菌落等到于物体表面上菌落数为 0.2cfu/cm 2。5 3 医护人员手样本检测5 3 1 将标本编号，振摇80 次后，吸 500ul 于普通琼脂平板中

10、，如为儿科、爱婴区、新生儿科、儿科ICU 的标本时，加做一个 HE平板，以监测沙门氏菌的检出。把平板摇均匀，放入35培养箱培养48 小时后，观察结果。5. 3. 2有菌生长，则挑取可疑菌落进行鉴定，排除金黄色葡萄球菌、B溶血链球菌、铜绿假单胞菌等致病微生物的检出。5. 3. 3结果计算及菌落换算手细菌菌落总数(cfu/c m 2)=平皿上菌落数X采样液稀释倍数(A) /30 X 2 (cm2),即平皿上1个菌落等到于物体表面上菌落数为2 0.33cfu/cm 。5 4 灭菌或一次性医疗用品样本检测5 4 1 样本采集完成后，接种于肉汤培养基，置35培养箱培养7 天，每天观察一次，培养基有混浊则

11、转种普通平板继续培养，观察最后结果。5 4 2 有菌生长，则挑取可疑菌落进行鉴定，结果报告是否检出细菌。5 5 使用中消毒剂5 5 1 细菌室收到标本后，将标本编号，振摇80 次后，吸 500ul 于普通琼脂平板中，如为儿科、爱婴区、新生儿科、儿科 ICU的标本时，加做一个HE平板，以监测沙门氏菌的检出。 把平板摇均匀， 放入 35培养箱培养48 小时后， 观察结果。另接种于 1 个沙保劳培养基，置28培养箱培养7 天，每天观察一次，观察最后结果。5 5 2 有菌生长，则挑取可疑菌落进行鉴定，结果报告是否检出细菌及真菌。5 5 3 结果计算及菌落换算使用中消毒剂细菌菌落总数（ cfu/ ml

12、） =平皿上菌落平均数X采样液稀释倍数（A） /采样体积（1ml）,即平皿上1个菌落等于消毒剂中菌落数为 10 cfu/ ml 。5 6 灭菌效果监测5 6 1 压力蒸汽灭菌效果监测 采用嗜热脂肪芽胞杆菌菌片， 放于溴甲酚紫蛋白胨水指示剂中，标本送检后，把里面的玻璃压碎，置于 56培养箱培养48 小时，如指示剂颜色为紫色，说明无嗜热脂肪芽胞杆菌生长；如指示剂颜色为黄色则说明有嗜热脂肪芽胞杆菌生长。5 6 2 气体灭菌效果监测 采用枯草芽胞杆菌菌片， 放于溴甲酚紫蛋白胨水指示剂中，标本送检后，置于35培养箱培养48 小时，如指示剂颜色为紫色，说明无枯草芽胞杆菌生长；如指示剂颜色为黄色则说明有芽枯

13、草胞杆菌生长。5 7 内镜标本检测5 7 1 将标本编号，用旋涡器充分震荡（振摇80 次） ，取 0.5ml ，加入直径 9CM的普通琼脂平板上， 把平板摇均匀， 放入35培养箱培养48 小时后计数， 观察结果。5. 7. 2有菌生长，则挑取可疑菌落进行鉴定，排除金黄色葡萄球菌、B溶血链球菌、铜绿假单胞菌等致病微生物的检出。5. 7. 3结果计算及菌落换算细菌菌落数/镜二平皿菌落数X 205. 8透析液样本检测 5. 8. 1将标本编号，振摇80次后，吸200ul于普通琼脂平板中，反平板摇均匀， 放入35c培养箱培养48小时，观察结果。5. 8. 2有菌生长，则挑取可疑菌落进行鉴定，排除金黄色

14、葡萄球菌，、B溶血链球菌、铜绿假单胞菌等致病微生物的检出。6. 8. 3结果计算：透析液细菌菌落总数 二平皿菌落数X 57. 质量控制6. 1做好培养基及样本采集液的质量控制，确保其无菌以及适宜于细菌的生长。7. 2标本采集严格按照采集要求进行。8. 3做好培养箱的温度控制。7.各类环境空气、物体表面、医护人员手细菌菌落总数卫生标准，见下表类别范围标准空气cfu/m 3物体表面cfu/cm 2医护人员手 cfu/cm 2I类层流洁净手术室、层流洁净病房< 10<5<5n类普通病房、产房、婴儿室、早产儿室、普通保护性隔离室、供应室无菌室、烧伤病房、重症监护病房<200&l

15、t;5<5田类儿科病房、妇产科检查室、注射室、换药室、治疗室、<500< 10< 10供应室清洁室、急诊室、化验室、各类普通病房和房间IV类传染病科及病房-< 15< 157. 2致病性微生物 不得检出金黄色葡萄球菌，、B溶血链球菌及其他致病性微生物。在可疑污染情况下进行相应指标的检测，母婴同室、早产儿室、婴儿室、新生儿及儿科病房的物体表面和医护人员手上，不得检出沙门氏菌。7. 3医疗用品卫生标准7.1.1 进入人体无菌组织、器官或接触破损皮肤、粘膜的医疗用品必须无菌7. 3. 2接触粘膜的医疗用品细菌菌落总数应0 20cfu/g或100 cm2,致病性微生

16、物不得检出。7. 3. 3接触皮肤的医疗用品细菌菌落总数应0 200cfu/g或100 cm,致病性微生物不得检出。7. 4使用中消毒剂卫生标准使用中消毒剂：细菌菌落总数应0100 cfu/ml ;致病性微生物不得检出。7. 5内镜消毒后的卫生标准细菌菌落总数应v 20cfu/件；致病性微生物不得检出。9. 6透析液消毒后的卫生标准1 .6.1入水口细菌菌落总数应v 200cfu/ml ;致病性微生物不得检出。7 . 6. 2出水口细菌菌落总数v 2000cfu/ml ;致病性微生物不得检出。8 .院感标本报告的录入10. 1在电脑点击“院感系统”，进入“院内检测”，在“环境卫生学及消毒灭菌效

17、果监测结果”中根据检测的结果输入相关的项目。输入抽检科别、标本类别、抽检项目、报告结果/ 细菌总数、标本单位、检出细菌、送检日期、报告日期、检验 者、院感受办抽查、次数。结果输完后按保存键，审核无误后按审核键。按录入键继续下一标本的录入。录入完毕退出系统。8 2 阴性院内感染监测标本的报告方式8 2 1 空气、物体表面、消毒液、灭菌生物监测菌片培养结果阴性发报告为“无菌生长” 。8 2 2 无菌物品培养结果阴性发报告为“无细菌生长” 。8 3 阳性院内感染监测标本的报告方式8 3 1 空气培养结果阳性发报告为“ XX cfu/m 3” 。8 3 2 物体表面培养结果阳性发报告为“ XX cfu/cm 2” 。8 3 3 消毒液培养结果阳性发报告为“ X