过氧化氢酶和黏附素保守区二价疫苗治疗小鼠幽门螺杆菌感染(一)

1、过氧化氢酶和黏附素保守区二价疫苗治疗小鼠幽门螺杆菌感染(一)    作者：白杨，陈丽，王继德，施理，唱韶红，张兆山，周殿元，张亚历【关键词】 幽门螺杆菌Immunzition treatment of Helicobacter pylori infection with two valence vaccine composed of catalase and adhesin conservation: An animal model study【Abstract】 AIM: To investigate the effects of two valenc

2、e vaccine consisting of Helicobacter pylori (H. pylori) catalase and adhesin conservation in the treatment of H. pylori infection in an H. pylori infected mouse model. METHODS: C57BL/6 mice infected with H. pylori were divided into seven groups. The mice of each group were immunized respectively by

3、catalase and adhesin conservation (separately, 100 g) plus CT (2 g), catalase (100 g) plus CT (2 g), adhesin conservation (100 g) plus CT (2 g), catalase (100 g), adhesin conservation (100 g) and CT (2 g), PBS orally once a week for four weeks. Four weeks after the last treatment, all animals were s

4、acrificed and stomach biopsies were collected to detect H. pylori by semiquantitative bacterial culture assay. RESULTS: The eradication rate of two valence vaccine group, single valence vaccine group of catalase and single valence vaccine group of adhesin conservation was 69.2%（18/26）, 30.8%（8/26） a

5、nd 38.5%(10/26), respectively. The eradication rate of the other four groups was all 0%. The H. pylori colonized density of the vaccination group was significantly lower than that of the other four groups (P0.05). There were significantly differences in the eradication rate and H. pylori colonized d

6、ensity between the two valence vaccination group and the single valence vaccination groups (P0.05). CONCLUSION: The two valence vaccine consisting of catalase, adhesion conservation and adjuvant has better immunotherapeutic effects than the single valence vaccine. More H. pylori vaccine research sho

7、uld be directed to the multivalence vaccine.【Keywords】 Helicobacter pylori; catalase; adhesin; vaccine【摘要】 目的：利用人类幽门螺杆菌(H.pylori)感染的小鼠模型研究过氧化氢酶和黏附素保守区二价疫苗治疗H.pylori感染的作用. 方法：把已感染H.pylori的小白鼠分成7组, 分别通过灌胃方法给予过氧化氢酶和黏附素保守区(各100 g)加霍乱毒素CT(2 g)、过氧化氢酶(100 g)加CT (2 g)、黏附素保守区(100 g)加CT (2 g)，PBS，单纯过氧化氢酶(100

8、g)、单纯黏附素保守区(100 g)、单纯CT (2 g),1次/wk,共4次,治疗结束后4 wk处死动物,取胃黏膜行半定量细菌培养检查H.pylori情况. 结果：治疗实验各组H.pylori根除率分别为: 过氧化氢酶和黏附素保守区加CT组69.2%（18/26）、过氧化氢酶加CT组30.8%（8/26）、黏附素保守区加CT组38.5%(10/26)；生理盐水组、单纯过氧化氢酶、单纯黏附素保守区、单纯CT组根除率均为0%. 未根除H.pylori的小鼠，疫苗治疗组H.pylori的定植密度明显低于其他4组（P0.05）. 此外，二价疫苗组的H.pylori根除率及定植密度较单价疫苗组均有显著

9、性差异（P0.05）. 结论：由过氧化氢酶和黏附素保守区加免疫佐剂组成的二价口服疫苗较单价口服疫苗有更好的免疫治疗效果,多价疫苗是未来H.pylori疫苗的研制方向.【关键词】 幽门螺杆菌；过氧化氢酶；黏附素；疫苗0引言我们已构建了幽门螺杆菌（Helicobacter pylori, H.pylori）黏附素保守区AB和过氧化氢酶的高效原核表达体系1,2，表达产物经过纯化后在体外探讨了它的安全性、免疫原性和生物活性3. 现通过建立感染H.pylori的小鼠模型观察过氧化氢酶和黏附素保守区二价疫苗治疗H.pylori感染的作用，为治疗性H.pylori疫苗的研制奠定基础.1材料和方法1.1材料幽

10、门螺杆菌ss1株为本所保存，无特定病原体（specificpathogen free， SPF）C57BL/6小鼠140只，4 wk龄，雄性，体质量1213 g，饲养条件符合2级动物要求. 重组黏附素保守区rAB、过氧化氢酶、快速尿素酶试剂由本所制备；其余试剂为国产分析纯. H.pylori的固体培养：取冷冻保存的H.pylori菌种一环于固体培养基上连续划线接种，2 h内置厌氧培养箱，37微需氧环境（50 mL/L O2, 100 mL/L CO2, 850 mL/L N2）中培养72 h，湿度保持95以上. H.pylori的菌落呈园形，凸起、光滑、灰白色、半透明，直径0.20.8 mm左

11、右. 液体培养：取固体培养基上生长的H.pylori菌落至布氏肉汤中，抽滤瓶抽气换气2次以满足微需氧条件，恒温振荡培养120 r/min培养4872 h. H.pylori的鉴定包括菌落形态、涂片观察（包括革兰染色观察细菌形态、暗视野观察细菌活力）、尿素酶实验（将自制尿素酶试剂加入含鼠胃组织的96孔板各孔中， 37作用5 min，当有H.pylori感染时试剂由黄色变为红色）. 灌胃用H.pylori的要求：革兰染色阴性，形态呈S形、螺旋形、杆状，暗视野下有活力，不含杂菌，密度约为1×1012/L.H.pylori感染小鼠模型的建立:采用文献4方法驯化H.pylori ss1株，分离

12、可在小鼠胃内稳定定植的H.pylori ss1株，固体培养23 d，菌落经鉴定后用布氏肉汤洗下，调整细菌浓度至1×1012 CFU/L，每只小鼠灌胃0.5 mL（约1×1012/L）. 所有动物灌胃前禁食12 h，禁水4 h. 灌胃后禁食2 h. 连续5次，1 wk完成. 采用胃管法以确保H.pylori灌入胃内. 末次灌胃后4 wk随机处死5只小鼠，剖腹取胃，沿纵轴将胃切为3部分，一份行快速尿素酶试验，一份置40 g/L甲醛固定供组织学检查，一份细菌培养，检查是否感染H.pylori.1.2方法将已鉴定感染H.pylori的小鼠随机分成7组：二价疫苗组：经口喂饲过氧化氢酶

13、和黏附素保守区各100 加 2 ；单价过氧化氢酶疫苗组：经口喂饲过氧化氢酶100 g加 2 ；单价黏附素保守区疫苗组：经口喂饲黏附素保守区100 g加 2 g；单纯过氧化氢酶组：经口喂饲过氧化氢酶100 ；单纯黏附素保守区组：经口喂饲黏附素保守区100 /次；单纯CT组：经口喂饲 2 ；PBS组：经口喂饲PBS 200 L/次. 前3组为治疗组，每组28只小鼠；后4组为对照组，每组10只小鼠. 免疫治疗前小鼠禁食12 h，禁水4 h. 每只小鼠先用30 g/L碳酸氢钠100 L灌胃以中和胃酸，10 min后分别按上述分组灌胃，30 min后再给小鼠提供水和食物. 隔周免疫，加强免疫3次，剂量同

14、前. 末次免疫后4 wk，禁食1 d，摘眼球放血处死动物，用750 g/L乙醇浸泡小鼠体表5 min以上. 在超净工作台内迅速取出胃用于免疫治疗后幽门螺杆菌根除的鉴定，方法采用半定量细菌培养法5，胃组织称质量后，制成匀浆，用布氏肉汤倍比稀释后，取200 L涂于Hp固体培养基，菌落计数后，计算单位胃组织的定植细菌密度.统计学处理：采用SPSS 10.0软件，计数资料行2检验，计量资料的比较采用方差分析，P0.05为有显著性差异.2结果经尿素酶实验、组织病理学检查（Fig 1）及细菌培养证实5只随机处死的小鼠全部感染H.pylori. 细菌培养发现胃组织H.pylori的定植密度为1×1

15、051×106/g.胃组织培养H.pylori为阴性者定为根除，疫苗治疗组根除率显著高于其他4组（P0.05，Tab 1）. 未根除H.pylori的小鼠，我们进行了H.pylori定植密度的分析，结果发现疫苗治疗组H.pylori的定植密度明显低于其他4组，其差异有显著性（P0.05）. 而且，二价疫苗组的H.pylori根除率及定植密度较单价疫苗组均有显著性差异（P0.05）.表1感染H.pylori小鼠免疫治疗后的根除率（略）3讨论H.pylori疫苗不单具有预防作用，同时还有治疗作用. 用重组尿素酶加上佐剂大肠杆菌不耐热毒素（LT）口服免疫已感染H.pylori的恒河猴，大多

16、数动物胃内H.pylori得到根除且胃炎明显好转6，7；免疫治疗已成为治疗H.pylori感染最有效、最有前景的方法之一. 同时也提示单一尿素酶抗原免疫不能达到最佳的治疗效果，为了确保免疫治疗效果必须寻找其他有效抗原成分来配制更有效的多价疫苗. 我们构建了针对H.pylori自我防护因素和黏附因素的多价疫苗过氧化氢酶和黏附素保守区构成的二价疫苗. 这一疫苗的研制既是对寻找其他有效抗原的探索，又是对H.pylori多价疫苗组方的尝试. 动物实验表明，单价过氧化氢酶疫苗和单价黏附素保守区疫苗的H.pylori根除率分别为30.8%和38.5%，即使未根除的小鼠，其H.pylori定植密度也有明显的

17、降低（P0.05），可用于H.pylori治疗性疫苗侯选抗原；由二者组成的二价疫苗，疗效明显提高，表现在定植密度的降低和根除率的提高（与单价疫苗比较P0.05），初步证实由这一组方构成的多价疫苗可用于H.pylori治疗性疫苗的研制. 我们仅对H.pylori多价疫苗的初步尝试，这一结果提示我们未来的H.pylori疫苗可能是针对H.pylori自我防护因素、毒力因素、黏附因素等多种因素所构成的多价疫苗.【参考文献】1 Bai Y, Zhang YL, Jin JF, et al. Recombinant Helicobacter pylori catalaseJ. World J Gastr

18、oenterol,2003;9(5):1119-1122.2 白杨,张亚历,王继德,等.幽门螺杆菌黏附素基因保守区的克隆及免疫原性研究J.中华医学杂志,2003,83(9):736-739.Bai Y, Zhang YL, Wang JD, et al. Cloning and immunogenicity of conservative region of adhesin gene of Helicobacter pyloriJ.Chin Med J, 2003;83(9):736-739.3 白杨,张亚历,陈烨,等.幽门螺杆菌粘附素保守区蛋白的免疫原性、安全性和粘附作用的体外评价J.生物化学与生物物理进展，2003;30(3):422-426.Bai Y,Zhany YL,Chen Y, et al.Study of Immunogenicity and safety a