Ⅰ型胶原与氧化性低密度脂蛋白相互作用的机制研究

1、    型胶原与氧化性低密度脂蛋白相互作用的机制研究*        摘要目的：阐明胶原与血清低密度脂蛋白(LDL)之间的关系。方法：在体外制备了型胶原凝胶，观察可能影响氧化LDL(ox-LDL)与胶原结合的几种因素。结果：随着LDL氧化程度增加，其与胶原的结合量也增加。结论：这种增加可能主要源于脂蛋白的负电性增加，LDL聚集度增大则可降低LDL与胶原的结合能力。另外，载脂蛋白B中赖、精、组、酪氨酸残基的化学修饰，可能在ox-LDL与胶原的结合中起重要作用。主题词胶原；脂蛋白

2、类，LDL；动脉粥样硬化 Studies on the mechanism of the interaction between type I collagen and oxidative low density lipoproteinWEI En-Hui, CHEN Qi, CHEN Xiu-Ying, WANG NanAtherosclerosis Research Center, Nanjing Medical University, Nanjing(210029)AbstractAIM:To elucidate the relationship between collagen and

3、 serum low density lipoprotein (LDL).METHODS:Preparing type collagen gel in vitro and observing the factors which may affect the ability of oxidized low density lipoprotein (ox-LDL) to bind with type collagen.RESULTS: It was found that the amound of LDL bound to collagen increased with the degree of

4、 LDL oxidation, which was accompanied by a progressive increase in the negative electric charge and a decrease in the size of lipoprotein. CONCLUSION:Chemically modified lysine, arginine, histidine and tyrosine residues of apolipoprotein B in ox-LDL might play significant role in the binding of ox-L

5、DL with collagen .MeSHCollagen; Lipoproteins，LDL;Atherosclerosis最新研究结果1表明，低密度脂蛋白在动脉壁的沉积可能是动脉粥样硬化(atherosclerosis,As)发生的重要环节，在动脉壁，低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)主要沉积于细胞外基质成分2，但有关结合的详细机制并不明了。胶原是细胞外基质中的主要成分，现已发现有6种亚型的胶原成分可出现于动脉壁3，其中，型和型胶原与ox-LDL结合的能力较强，这与脂蛋白所带负电荷的多少有关4。载脂蛋白B(apoB)中氨基酸残基的性质改变决定了脂蛋白的

6、荷电性，一般认为赖氨酸残基在受体识别和与细胞外基质的结合中起重要作用5。然而，有证据表明，LDL的氧化反应不仅涉及赖氨酸修饰，还有精、组、酪氨酸残基的修饰6，7。因此，研究这些氨基酸残基的修饰在LDL与胶原结合中的作用，对阐明LDL与胶原结合的机理有重要意义。为此，我们从大鼠鼠尾中分离提取了型胶原，并在体外制成胶原凝胶，研究了脂蛋白与胶原的反应性及其影响因素。材料与方法一、材料及仪器：Na125(无载体)为中国原子能科学研究院产品，牛血清白蛋白系进口分装，DMEM培养基购自Gibco公司，琼脂糖为Serva公司生产，1，1，3，3-四甲氧基丙烷，多聚赖、精、组、酪氨酸为Sigma公司产品，4-

7、羟基壬烯醛(4-hydroxynonenal,HNE)系奥地利格拉茨大学Jurgens教授馈赠，其余试剂均为国产分析纯。超速离心机及Ti 80转头为美国Beckman公司生产，二氧化碳培养箱购自德国Heraeus公司，电泳仪为瑞典LKB公司产品，自动计数仪购自中科院上海原子能研究所日环仪器厂。二、方法：(一)脂蛋白的分离和氧化：序列超速离心法分离人血清LDL(d=1.0191063 g/L)脂蛋白浓度用Lowry法测定，LDL经滤菌后贮于4备用8，所有的LDL经电泳鉴定均为一条带。按McFarlane单氯化碘法制备125-LDL，比放活性为80300 counts.min1/ng1蛋白，游离碘

8、率不超过2%。LDL氧化修饰系Cu2+介导法8，LDL与4种不同终浓度的Cu2+作用后，获得4种修饰程度不同的ox-LDL(表1)。ox-LDL的相对电泳迁移率(relative electrophoretic mobility, REM)经琼脂糖凝胶电泳检测，以ox-LDL与LDL实际迁移距离之比来表示8；而ox-LDL的聚集程度则以OD680nm的吸光值表示9。(二)多聚氨基酸的修饰：将多聚精、酪、组、赖氨酸分别溶于pH为3.5、10.0、6.0和8.0磷酸盐缓冲液PBS中，待其完全溶解后，分别用丙二醛(malondialdehyde, MDA)和HNE修饰。反应中4种多聚氨基酸终浓度为2

9、.0 g/L，MDA终浓度为45 mmol/L，而HNE的终浓度为5 mmol/L，置37孵育5 h后，于相应pH的PBS中透析，24 h后取出，贮于4冰箱内备用6。(三)胶原凝胶的制备：从大鼠尾腱中提取型胶原，即将鼠尾腱用0.1%的醋酸溶液浸泡48 h后，经离心获得上清液，即型胶原，经Van-Gieson染色呈特征性绿色荧光，其蛋白含量用Lowry法检测。在冰浴中将胶原溶液(终浓度1.0 g/L)、DMEM、三蒸水快速混合并应用0.17 mol/L的NaOH调pH至7.0，DMEM终浓度为细胞培养用液的1/10。迅速将所得溶液1 mL移至35 mm直径的培养皿内，置37、体积分数为5%CO2

10、、95%空气、100%湿度条件下孵育，直至完全成胶。上述操作均在无菌条件下进行10。(四)125-LDL与胶原凝胶结合值的测定：分别于胶原凝胶中加入含125I标记的天然或氧化修饰LDL的DMEM液1 mL，置于二氧化碳培养箱中孵育，待48 h后取出(其余见2)，刮除凝胶，放入内有新华1号滤纸的漏斗上，用50 mL PBS分多次冲洗，将洗过的胶原凝胶转移至含有3 mL的1 mol/L NaOH的试管中，待其完全溶解后，分别取部分测定放射性和蛋白含量，125I-LDL胶原的结合值以mg脂蛋白/g胶原蛋白表示10。三、统计学处理：数据以均数±标准差(±s)表示，数据处理采用stu

11、dentt检验、方差分析和秩和检验。结果一、125I-LDL与胶原凝胶的结合特性：为去除非特异性吸附于胶原凝胶上的LDL，在测定胶原结合量前对凝胶进行了冲洗 ，结果发现，若用50 mL PBS分10次冲洗，如1所示，在第一个5 mL冲洗液中，洗出的未结合125I-LDL量较大，而到第810个5 mL冲洗液时，所含125I-LDL已极其微少，仅为第一个5 mL冲洗液的1.23%1.44%，因此在本研究中选用50 mL PBS来冲洗胶原凝胶。Fig 1Amount of 125I-LDL in the washing solution of collagen gel1胶原凝胶冲洗液内125I-LD

12、L的含量变化 观察孵育时间对125I-LDL与胶原凝胶结合的影响，可见随着孵育时间的延长，二者的结合能力也逐渐增强，尤以最初6 h内增加最迅速，约36 h后趋于平稳(2)。在脂蛋白与胶原凝胶共同孵育48 h后，125I-LDL和125I-ox-LDL与胶原结合的能力均与脂蛋白呈剂量依赖关系，当脂蛋白终浓度10 mg/L时，ox-LDL与胶原的结合能力逐渐高于LDL(3)。二、脂蛋白的负电性、聚集程度对其与胶原结合能力的影响：Fig 2Relationship between 125I-LDL bound to collagen gel and incubating time2125I-LDL胶

13、原结合值与孵育时间的关系Fig 3Relationship between 125I-LDL bound to collagen gel and lipoprotein concentration3脂蛋白的胶原结合值与其浓度关系曲线 表1ox-LDL的相对电泳迁移率、聚集度与其胶原结合值的关系Tab 1 Relationship between REM, OD680nm of ox-LDL and 125I-LDL bound to collagen gel(n=3)LipoproteinREMOD680nm125I-LDL bound to collagen(mg/g protein)Nat

14、ive LDL1.0003.194±0.274Mildly modified2.600.0077.860±0.709*ox-LDLModerately3.000.01011.998±0.060*modified ox-LDLHeavy ox-LDL3.000.03015.200±1.843*Oxidized2.860.07011.461±0.552*aggregated LDLMildly and Moderately modified ox-LDL was generated by incubating 0.2 g LDL/L PBS, pH

15、 7.35, with 10molL CuCl2 at 37 for 20 and 33 hours separately; heavy ox-LDL was generated by incubating 0.5 g LDL/L PBS, pH 7.35, with 40 mol/L CuCl2 at 37 for 20 hours and oxidized aggregated LDL was generated by vortexing heavy ox-LDL for 30 seconds.*P0.01,vs native LDL 为阐明负电荷及脂蛋白的聚集程度对ox-LDL与胶原结合

16、能力的影响，我们在体外制备了4种不同程度修饰的ox-LDL，从表1中可以看出，随着LDL氧化程度的增加，其与胶原的结合能力也增加，且二者的结合能力与脂蛋白的REM呈正相关(rs=0.924,P0.01)，而对重度氧化LDL和氧化聚集LDL的OD680nm和胶原结合值进行秩和检验，T=6,P0.05。三、4种不同修饰氨基酸对125I-ox-LDL与胶原结合能力的影响：为探讨氨基酸残基在脂蛋白与胶原结合中的可能作用，分别选用LDL脂质过氧化反应时的两个重要产物MDA和HNE来修饰多聚赖、精、组、酪氨酸，观察其对ox-LDL与I型胶原结合能力的影响，结果见4种多聚氨基酸及其MDA和HNE修饰形式均可

17、抑制二者之间的作用，抑制率为15%50%不等。而与相应的多聚氨基酸作用相比较，MDA修饰的赖、组、酪氨酸及低剂量的精氨酸和HNE修饰的精、酪氨酸及高剂量的赖氨酸均可减弱相应氨基酸的抑制作用，但高剂量的MDA修饰精氨酸、HNE修饰组氨酸和低剂量的HNE修饰赖氨酸则可轻度增强这种抑制作用(表2)。表24种修饰多聚氨基酸对ox-LDL与胶原结合值的抑制Tab 2 Inhibition of four types of modified amino acid on the binding of ox-LDL to collagen gel (n=3,%)LysArgHisTyr100g300g100g

18、300g100g300g100g300gPoly aa100100100100100100100100MDA-aa43537211193805063HNE-aa115858778991266187讨论型胶原与脂蛋白的相互作用，一般认为可分为扩散和结合阶段10，本研究中应用50 mL PBS冲洗胶原凝胶，可去除98%以上的非特异吸附部分，保证了检测结果的可靠性。LDL与胶原的结合量随孵育时间的延长而增加，并与脂蛋白浓度呈正比。但ox-LDL的结合能力明显高于天然LDL。结果显示，随着ox-LDL的REM增高，其与胶原结合能力也越强，提示ox-LDL所带负电荷的多少可能是其与胶原结合能力的影响因素

19、，而非唯一因素，因为中、重度ox-LDL的REM一致，但二者的胶原结合值却不同。由于影响脂蛋白迁移活性的因素除电荷以外，尚与脂蛋白分子形状和聚集程度有关，故在体外制备了重度ox-LDL和氧化聚集LDL，观察二者与胶原结合能力的强弱，结果可见后者的结合能力弱于前者，由于重度ox-LDL和氧化聚集LDL制备时反应条件完全一致，故认为二者所带负电荷也一致，但后者的聚集程度远远高于前者，提示可能是由于脂蛋白聚集程度增加而导致颗粒直径增大，因分子筛效应，聚集程度较高的脂蛋白不易扩散进入胶原凝胶，从而其与胶原结合的量也相应减少。本研究结果尚显示，多聚赖、精、组、酪氨基酸均可程度不同地抑制125I-ox-L

20、DL与胶原的结合，提示这四种氨基酸残基均可能参与作用。而高剂量MDA修饰精氨酸、HNE修饰组氨酸以及低剂量HNE修饰赖氨酸均可轻度增强相应多聚氨基酸的作用，而其他类型修饰氨基酸作用则弱于相应多聚氨基酸。出现这种结果的原因尚不清楚，但4种多聚氨基酸修饰以后的不同作用，提示脂蛋白与胶原的结合是一个复杂的过程，可能是多种氨基酸残基共同作用的结果，但最终ox-LDL与胶原结合能力的增强是否主要取决于不同氨基酸在apoB中的比例抑或其他原因，尚有待进一步研究证实。*国家自然科学基金资助作者单位：南京医科大学动脉粥样硬化研究中心(南京210029)参考文献1Williams K J, Tabas I. T

21、he response-to-retention hypothesis of early atherosclerosis. Arterioscler Thromb,1995, 15:551.2Jurgens G, Chen Q, Esterbauer H, et al. Immunostaining of human autopsy aortas with antibodies to modified apolipoprotein B and apoprotein (a). Arterioscler Thromb, 1993,13:1689.3Wight T N. The extracellu

22、lar matrix and atherosclerosis. Curr Opin Lipidol, 1995,6:326.4Jimi S, Sakata N, Matunagu A, et al. Low density lipoproteins binds more to type I and collagens by negative charge-dependent mechanism than type and collagens. Atherosclerosis, 1994, 107:109.5Auerbach B J, Bisgaier C L, Wolle J, et al. Oxidation of low density lipoproteins greatly enhances their association with lipoprotein lipase anchored to endothelial cell matrix. J Biol Chem, 1996, 271:1329.6C