PMP柱前衍生高效液相色谱法分析杜氏盐藻多糖的单糖组成-

1、第26卷第2期2007年3月分析测试学报FENXI CESH I XUEBAO(J ournal of In stru m en talAnal ysisV ol.26No.2206210 P MP柱前衍生高效液相色谱法分析杜氏盐藻多糖的单糖组成戴军1,2,朱松1,汤坚1,2,王3,尹鸿萍3,陈尚卫1(1.江南大学分析测试中心,江苏无锡214036;2.江南大学食品科学与安全教育部重点实验室,江苏无锡214036;3.中国药科大学生命科学学院,江苏南京210009摘要:建立了柱前PM P衍生高效液相色谱法分离检测8种中性糖、2种糖醛酸及2种糖胺的方法。筛选出适合PM P衍生物分离的色谱柱为Ec

2、li pse XDB-C18,以0.1m ol/L磷酸盐缓冲液-乙腈为流动相,考察了p H值和乙腈体积分数对各种糖的PM P衍生物的保留及分离的影响,确定最佳p H值为6.7,最佳乙腈体积分数为17%;比较了不同衍生反应时间和萃取除杂前不同量盐酸中和反应产物时醛糖-PM P衍生物的峰面积大小变化,从而得到较佳的样品衍生化条件。应用优化的色谱条件和样品制备方法,测定了由杜氏盐藻提取纯化的多糖级分PD4a和PD4b的单糖组成,其测定结果与高效阴离子交换色谱法的结果基本一致。关键词:杜氏盐藻;多糖;单糖;高效液相色谱;柱前衍生化;1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮中图分类号:O657.72;O629.

3、112文献标识码:A文章编号:1004-4957(200702-0206-05A nal ysis ofM onosacchari de Co mpositi ons i n Po l ysacchari des fro m D.Sa li naby P re-co l u m n D eri vatiza tion H i gh Perf o r m ance L i qui d Ch ro m atographyDA I Jun1,2,ZHU Song1,TANG Jian1,2,WANG M in3,Y I N H ong-p i n g3,CHEN Shang-we i1(1.Te s

4、ti ng&A nalysis C en t e r o f Southe rn Y angtze U niversity,W uxi214036,China;2.K ey L aboratory ofF ood Science and Sa fety,M inistry o f Educati on,Sou t hern Y ang tze U niversit y,W ux i214036,Chi na;3.Co llege of L ife Science,Ch i na P ha r maceutica lU nive rsity,N an ji ng210009,ChinaA

5、bstract:A si m p le and sensitive h i g h pe rfo r m ance liquid ch r o m a t o graph ic m ethod for si m u ltaneous de t e r m i n ation o f eigh t kinds of neu tra lm onosaccharides,t w o kinds of ur onic acid and t w o kinds of g ly-cosa m i n e by pre-colu m n derivatization w it h1-pheny l-3-m

6、ethy l-5-py razolone(P MPhas been deve l-oped.The e ffec ts of volum e r a tios o f aceton itril e t o phosphate buffe r and pH ofm ob il e phase on r e ten-tion and separa tion of P M P deriva ti v es of the ten m onosaccharides we r e investigated w it h E clipse XPB-C18Co l u m n(4.6mm×250mm

7、.The results sho w ed t h at the opti m um volum e ratio of ace tonitrile to buffer w as1783and tha t t h e pH w as6.7.The variations o f the peak ar eas o fm onosaccharides de riv-atives due to d ifferen t reaction ti m es and a m ounts ofHC l f o r neutr a liza ti o n of t h e r eacti o n sy ste m

8、 s w ere co m par ed to obtain better sa m p l e preparation conditions.The deve l o ped m ethod w as successfull y ap-plied to the analyses o fm onosaccharide co m positions i n the po l y sacchari d e fractions(PD4a and PD4b fro m D uanaliell a Salina(D.Salina.The ana l y tica l r esu lts obtained

9、 on t h e whole ag reed w ith t h o se ob-tained by high-perfo r m ance anion-exchange chro m atography w ith pulsed-a m pe r o m e tric de tection.Key wor ds:Duana liella salina;Polysaccharides;M onosaccharide;H igh perfor m ance liquid chro m a-t o graphy;Pre-co lu m n de rivatization;1-Phenyl-3-m

10、 e t h y l-5-py razo l o ne杜氏盐藻(D uanaliell a Sa lina是单细胞、无细胞壁的绿藻类浮游生物,人工大规模培养杜氏盐藻主要用于提取-胡萝卜素。其提取后的藻渣中存在含量丰富的多糖类物质,由于具有免疫调节、抗病毒、抗肿瘤等多种生物活性,其研究开发具有重要意义1-2。而盐藻多糖的单糖组成的分析是其性质、结构及构效关系研究的一项基本且重要的内容。由于单糖极性较强,结构相近,且缺乏光学活性,故为了改善其分离选择性和提高检测灵敏度,人们常将多糖水解后采用柱前或柱后衍生化色谱法分离和检测3-6。其中1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(P MP柱前衍生化高效液相色谱

11、法反应条件较温和,产物无立收稿日期:2006-10-25;修回日期:2006-12-25基金项目:云南省省院省校科技合作项目(2001M AABA00A028作者简介:戴军(1958-,男,江苏盐城人,副研究员,硕士;汤坚,联系人,Tel:0510-*,E-m ail:daihplc163.co m207第2期戴军等:P M P柱前衍生高效液相色谱法分析杜氏盐藻多糖的单糖组成体异构,紫外检测灵敏度较高,故得到较为广泛的应用6-9。本文针对多糖中可能含有的单糖种类较多的特点,在前人工作的基础上,对该方法进一步进行了较系统深入的优化研究,从多种不同反相柱中筛选出分离选择性较好的Ec lipse X

12、DB-C18柱,以0.1m o l/L磷酸盐缓冲液-乙腈为流动相考察了乙腈比例和pH值对8种中性糖和2种糖醛酸的P M P衍生物的保留值及分离效果的影响,比较了不同反应时间的衍生产物峰面积大小和衍生反应后使用不同量盐酸中和体系时的后续萃取效果,并利用优化的方法测定了杜氏盐藻多糖的单糖组成。同时用离子色谱法对其结果进行了验证比较,两方法的分析结果基本一致。1实验部分1.1仪器与试剂Ag ilent1100高效液相色谱仪,包括G1311A四元泵,G1315B DAD检测器,G1313A自动进样器, G1379A在线脱气机,G1316A柱温箱,Ag il e nt1100化学工作站(美国Ag il

13、e nt公司;I CS3000离子色谱仪(美国D ionex公司。衍生化试剂:1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(P MP,纯度99%(美国A cros O r gan ics公司;乙腈, H PLC级(美国Tedia公司;三氟乙酸,纯度不低于99%(国药集团化学试剂有限公司。单糖标准品:葡萄糖(G lc,99%、甘露糖(M an,99%、半乳糖(Ga l,99%均购于上海化学试剂公司;鼠李糖(Rha m,99%、岩藻糖(Fuc,99%、葡萄糖醛酸(G lc UA,99%、半乳糖醛酸(Ga l U A,97%均为美国S i g m a-A l d rich公司产品;木糖(Xy l,98%、氨基葡

14、萄糖(G lc N,98%、氨基半乳糖(Gal N,99%均为美国A cr os Organics公司产品;核糖(R i b,>99.0%、阿拉伯糖(A ra,99%均购于厦门星隆达生化试剂有限公司。超纯水;其它试剂均为分析纯。杜氏盐藻多糖用内蒙古兰太生物工程公司提供的杜氏盐藻粉提取和纯化制得10。1.2混合单糖标样的衍生分别取100L的混合单糖标准液(各单糖质量浓度均为0.36g/L左右与100L的0.6m ol/L N a OH溶液,置于1m L的具塞试管中混合均匀;再取50L的混合液于5m L的具塞试管中,加50L 0.5m o l/L的P M P(0.4355g/5m L甲醇溶液

15、,漩涡混匀;在70烘箱中反应100m in;取出放置10 m in冷却至室温;加50L0.3m o l/L的HC l中和;加水至1m L,再加等体积的氯仿,振摇,静置,弃去氯仿相,如此萃取3次。将水相用0.45m微孔膜过滤后供H PLC进样分析。1.3样品制备吸取100L质量浓度为45g/L的多糖样品溶液于5mL的具塞刻度试管中,加入100L的4 m o l/L TFA,充N2封管,110烘箱中水解2h7,9;冷却后打开盖,加200L甲醇后用N2吹干,如此重复加甲醇并用N2吹3次,去除TF A;加入50L0.3m o l/L N a OH溶液充分溶解残渣,再加50L 0.5m ol/L的P M

16、 P甲醇溶液,漩涡混匀,同样在70的烘箱中反应100m i n,冷却后按“1.2”同法中和、萃取,并用微孔膜过滤。1.4色谱条件1.4.1液相色谱条件色谱柱:ZORBAX Eclipse XDB-C18,250mm×4.6mm i.d.,5m;流动相: 0.1m o l/L磷酸盐(pH6.7缓冲液-乙腈(体积比为8317;柱温:30;检测波长:250nm;流速:1mL/m in;进样体积:20L。1.4.2离子色谱条件色谱柱:Ca r boPac PA203mm×150mm;流动相:A为H2O,B为250mm ol/L N a OH,C为1m o l/L N a Ac,三元

17、梯度洗脱程序:021.0mm,99.2%A,0.8%B,0%C;21.1m in, 94.2%A,0.8%B,5%C;30.0m in,79.2%A,0.8%B,20%C;30.150.0m in,20%A,80%B, 0%C。流速:0.5mL/m in;积分脉冲安培检测器,金电极,四电位波形。进样体积:20L。2结果与讨论2.1色谱柱的选择以0.1m o l/L磷酸盐(pH6.7缓冲液-乙腈(体积比为8317为流动相,分别试用W a t e rsA tlan tis分析测试学报第26卷dC 18、W ate rs Sy mm e try C 18、ZORB AX Ex t e nd -C 1

18、8、ZORB AX Ec lipse XDB -C 18、H ype rsilAA -ODS 、Venusil XDP C 186种不同反相柱(均为250mm ×4.6mm i .d ,5m 进行“1.1”中所述8种中性糖和2种糖醛酸的分离,结果表明ZORB AX E cli p se XDB -C 18柱分离效果较好,且分析时间较短(图1。2.2流动相p H 及乙腈体积分数对分离的影响以磷酸盐缓冲液-乙腈为流动相反相分离P M P -醛糖衍生物时,缓冲液的pH 是一重要的影响因素,文献选用的p H 大多为56左右6,8,10。本文先用0.1m o l /L 磷酸盐缓冲液(pH 6.

19、0-乙腈作流动相,考察了乙腈比例对上述8种中性糖和2种糖醛酸在ZORBAX E clipse XDB -C 18柱上的保留值及分离效果的影响,结果显示:乙腈的体积分数为17%时分离较好。实验进一步考察了缓冲液的pH 对各种糖的保留值及分离效果的影响。结果表明:pH 为6.7左右时分离效果最佳,分析时间较短,出峰间距较均匀。图1显示在该最佳条件下两种糖胺也可与这8种中性糖和2种糖醛酸同时分离( 两组混标色谱图显示于同一坐标中。本文方法不需梯度洗脱即可同时实现12种单糖-P M P 衍生物的分离,比文献中的分离效果好,且同时分离的单糖较多。2.3衍生化反应时间的选择文献中的衍生化反应时间大多为30

20、m in6-7,9,个别选用2h8。本文在其它条件(如“1.2”所述相同情况下,将上述8种中性糖和2种糖醛酸的混合标样分别采用不同反应时间(30、50、70、100和120m in 进行衍生化,考察衍生化产物的峰面积大小变化,结果表明:反应时间为100m in 时各种糖的P MP 衍生产物的峰面积均为最大值,70m in 次之;100m in 时各种糖的P MP 衍生产物总的峰面积比30m in 大30%左右,故衍生化反应时间选为100m in 。2.4酸度对萃取效果的影响衍生反应完成后,为去除过量的衍生化试剂,需用氯仿萃取。由于如图2所示的P M P -醛糖衍生产物的化学结构中含有碱性基团(

21、在较高p H 值时不解离,因而易被氯仿萃取而损失,故在萃取前中和反应体系中的碱所用的盐酸量对糖的P M P 衍生物在萃取过程中的定量回收或损失应有一定的影响。若中和不够,pH 较高,糖的P M P 衍生物在氯仿中有一定的溶解度,在萃取中的损失较显著7。因此文献中有使用等当量的盐酸中和反应液中的氢氧化钠6,也有使用过量的盐酸中和使pH 为酸性(p H 347或458,即相当于本法中使用57L 或62L 的HC l 中和。本文考察比较了不同体积(50、57、62、67L 的HC l (0.3mo l /L 中和后的萃取效果,结果表明,使用等当量的盐酸(50L 中和即可,此时大多数单糖-P M P

22、衍生物的峰面积较大,且10种糖衍生物的总的峰面积最大。此现象说明p H 值太低也会增大单糖-P MP 衍生物的损失,这可能是因为在酸性条件下,衍生产物不太稳定。2.5检测线性及检出限将8种中性糖和2种糖醛酸配制成一系列不同浓度的混合标样,分别按“1.2”衍生化,并在“1.4”所述条件下进样检测,以测得的各种糖的峰面积对相应浓度作工作曲线,结果见表1。以3倍信噪比计得这10种单糖的检出限为0.0810.271n m o l (表1。由此可见,本方法的检测线性很好,线性范围较宽,检测灵敏度较高。208第2期戴军等:P M P 柱前衍生高效液相色谱法分析杜氏盐藻多糖的单糖组成表1方法的检测线性及检出

23、限T ab le 1Ca libra tion curves and de tection li m its o f t en m onosaccharidesS ugar Regression equation C orrelati on coefficientR 2Li near rangec /(mm ol L Detection li m itn /nm ol M an Y =373.81X +2.06510.99990.01048.330.081Ri bY =371.06X -5.54320.99980.01179.380.12Rha m Y =373.4X +5.04640.999

24、80.01149.090.17G lc UA Y =342.33X -21.7280.99830.009647.720.20Gal UA Y =406.76X -12.7110.99960.01018.060.20G lc Y =336.34X -6.53530.99980.01028.150.13Gal Y =406.73X -7.06650.99980.01038.210.16Xyl Y =312.22X -10.0840.99950.01249.910.27A ra Y =389.78X -6.50080.99990.01229.760.14Fu cY =375.58X -3.02720

25、.99980.01149.080.10Y :peak area ;X :s ugar concen trati on (mmo l /L 2.6杜氏盐藻多糖的单糖组成测定按“1.3”中的水解和衍生化方法及“1.4”中的色谱条件测定了纯化后的两个主要盐藻活性多糖级分10的单糖组成,其结果和色谱分离图谱见表2和图3。PD4a 和PD4b 的各糖组分峰的定性除据保留时间和DAD 紫外光谱图外,还用液相色谱-质谱联用分析给予验证(LC -M S 分析内容另文发表。在PD4a 图谱中,分别靠近核糖(R i b 和葡萄糖(G lc 峰前均有一小峰,两者保留时间分别与葡萄糖胺和半乳糖胺标样的P MP 衍生物

26、保留时间很接近,但用LC -M S 分析证实这两峰均不是糖胺。为了以不同方法验证本文方法的定量结果,同时用离子色谱法11也测定了这两个多糖级分水解后的单糖组成,其结果与P MP 柱前衍生化法基本一致(见表2。表2杜氏盐藻多糖级分PD4a 和PD 4b 的单糖组成(摩尔分数x /%,n =3Table 2M onosaccharride co m positi ons o f t wo po l y saccha ri de fracti ons (PD4a and PD 4b from D .salina (mo l frac tion x /%,n =3Fracti on M et hod

27、M anAverage RSD s r /%RibAverage RSD s r /%Rh a mA verage RSD s r /%G lc UAAverage RSD s r /%G al U AAverage RSD s r /%PD4a P M P1.573.541.323.172.363.220.785.221.64 4.80I C 1.552.72 1.333.242.87 3.980.814.87 1.70 4.32PD4bP M P 0.874.8768.112.920.75 3.040.00/0.00/I C 0.833.7967.962.650.694.020.00/0.

28、00/Fracti on M et hod G lcAverage RSD s r /%GalAverage RSD s r /%XylA verage RSD s r /%A raAverage RSD s r /%Fu cAverage RSD s r /%PD4a P M P 5.183.3131.533.2424.36 2.9326.963.294.30 2.87I C5.542.1632.062.5722.38 2.8426.923.05 4.84 3.19PD4bP M P 8.212.077.812.226.84 3.166.473.730.94 3.45I C8.172.137

29、.892.306.882.296.543.971.043.06 图3杜氏盐藻多糖级分PD 4a 和PD 4b 水解样品的PM P 衍生化产物的色谱图F i g .3Ch ro m a t og ram s of P M P derivati ve s of ac i d hydrolyza t e s of t wo polysaccha ri de frac tions (PD4a andPD4b from D .s a li na3结论本文建立的P M P 柱前衍生化高效液相色谱分析单糖的方法准确可靠,灵敏度较高,可同时分离检209210分析测试学报第26卷测的单糖数量较多,取样量少,且分

30、离效果较理想。本法尤其适用于微量多糖样品的单糖组成测定。由本法测定的杜氏盐藻活性多糖级分的结果显示,PD4a中主要含有半乳糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖及盐藻糖5种中性糖,还含有少量糖醛酸;另一种多糖级分PD4b中主要含有核糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖及木糖5种中性糖,不含糖醛酸。致谢:戴安中国有限公司北京应用研究中心的梁立娜博士和上海农科院食用菌研究所的刘艳芳工程师对本文的离子色谱分析实验给予热心帮助,谨表衷心谢意参考文献:1丁新,李玲凤.关于盐藻多糖的研究J.海湖盐与化工,1996,24(6:4-6.2FABREGAS J,GARCI A D,FERNANDEZ-A LON SO M.In v

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