逆转录聚合酶链反应-微孔板反向杂交检测丙型肝炎病毒

1、    逆转录聚合酶链反应-微孔板反向杂交检测丙型肝炎病毒        近几年研究结果表明，丙型肝炎病毒（HCV）是引起输血后肝炎的主要病原之一。1990年Weiner等1首先建立了RT-PCR法检测HCV RNA，近几年来已被广泛应用于HCV的研究，但该法采用套式PCR技术，操作繁琐耗时且易引起交叉污染而出现假阳性。为此，我们建立了RT-PCR微孔板反向杂交法，采用HCV特异性探针与PCR扩增产物进行反向杂交，经酶呈色观察结果，不仅提高了检测敏感度与特异性，而且简化了操作

2、，节省了时间，应用于临床后反应较好，现报告如下。 材料与方法标本来源：标本来自本院传染科门诊与病房肝炎患者，共105例，分离血清后-20贮存。引物：根据Takamizawa2报道的HCV全序列，于5非编码区（5-UTR）设计引物，上游引物为5biotin-CAGAAAGCGFTCTAGCCAT,下游引物为5biotin-CTCTCAAGCACCCTATCAGGCA，探针为5TGGGCTGGGGATCTAAGGTGC。HCV RNA提取：采用硫氰酚胍-酚-氯仿进行抽提，具体方法见文献3。RT-PCR：于各样品管中加入20l逆转录反应液3，42 45分钟，95 10分钟灭活逆转录酶。取5l逆转录产

3、物加入25l PCR反应液3，在GeneAmp9600上94预变性3分钟，94 40秒、55 40秒、72 65秒，35次循环，最后72延伸10分钟。探针固相化：捕获探针与变性液等量混匀后取25l和100l杂交液加入微孔板，37 2小时，弃去液体，加封闭液200l，37 2小时，弃去液体，真空抽干置-20保存，至少可用1月。扩增产物检测：将扩增产物用蒸馏水稀释10倍后与变性液等量混匀，取25l加入微孔板，每孔加100l杂交液，37 50分钟，用pH7.4 Tris-HCl洗板5次。每孔加100l 酶标亲和素应用液，37 20分钟，洗板同前。然后TMB-H2O2显色，酶标仪测定450nm处的吸光

4、度（A值）。结果和讨论1.灵敏度试验：取HCV阳性血清，用正常人血清进行10倍系列稀释，套式PCR电泳法3作为对照。血清稀释10-4倍时，电泳法无阳性条带，而本法在血清稀释10-6倍时仍为阳性（A值为0.21）。2.重复性试验：取HCV阳性血清，用本法连续重复检测20次，A值为0.46±0.06(±s),CV为10.3%。取HCV弱阳性血清10次重复测定，A值为0.17±0.02(±s),CV为11.5%。3.NaOH浓度的影响：取不同浓度NaOH观察其对产物变性效果的影响。当NaOH浓度为0.30.4mol/L时曲线较平坦，浓度过高或过低都可使A值降低

5、，这可能是由于双链DNA解链不完全或DNA片段断裂所致。  4.杂交和酶反应时间的影响：将HCV阳性血清分成2组，且设立各管阴性对照，分别观察不同杂交时间和酶反应时间对结果的影响（见表1）。随杂交时间延长A值逐渐上升，大于60分钟后，阴性对照A值也随之迅速上升，且上升速率大于测定管上升速率，影响了杂交的严格性和敏感性，故杂交时间应以4060分钟为宜。由于生物素和酶标亲和素亲和力强，因此酶反应时间为2030分钟时显色效果就较为满意。表1不同杂交时间和酶反应时间的杂交结果组别杂交、反应时间(分钟)102030405060708090一组样本对照0.120.180.200.310

6、.350.360.380.390.400.010.010.020.040.040.050.120.170.17二组样本对照0.250.400.420.450.440.500.540.530.570.010.040.050.110.180.230.240.250.275.产物用量的影响：Tatsuji等4曾报道，当扩增产物稀释100125倍时吸光度达到最佳。我们用蒸馏水分别将HCV阳性和阴性对照扩增产物进行5倍系列稀释，然后用本法进行检测，A值分别为0.36(50)，0.42(5-1)，0.43（5-2），0.34(5-3)，0.29(5-4)，0.21(5-5），阴性对照平均A值为0.07。结

7、果显示扩增产物用蒸馏水稀释525倍，A值较为理想。6.不同洗板液的影响：分别采用以下5种缓冲液观察其对洗板效果的影响，（1）蒸馏水，（2）蒸馏水加Tween-20，（3）生理盐水加Tween-20，（4）PBS 加Tween-20，（5）Tris-HCl加Tween-20，结果显示以最后一种为最佳。7临床样本检测：分别用本法、单式PCR电泳法、套式电泳法检测各型肝炎患者105例，其中19例经肝穿刺病理活检确诊为HCV患者。本法检出HCV RNA阳性19例，符合率为100%，其中两例测序显示与Takamizawa2报道的核苷酸同源性为93.1%94.1%（测序由中科院上海植生所完成）。单式PCR

8、电泳法只检出16例，漏检3例。而套式电泳法检出20例，假阳性1例。我们建立的RT-PCR微孔板反向杂交法检测HCV RNA，采用一次扩增，并预先将HCV特异性探针固相化于微孔板上，与扩增产物进行反向杂交，使方法更为简便快速，整个过程仅需68小时，并消除了非特异性扩增产物的影响，避免出现假阳性，提高了方法的特异性，重复性也较好，检测灵敏度比套式PCR电泳法至少高100倍。由于采用了酶呈色技术，与同位素法相比，观察结果更为直观准确，试剂稳定，来源方便，且无污染，有利于以后对HCV RNA进行半定量、定量及自动化分析，可逐步取代电泳法而作为HCV RNA的常规检测方法。 作者单位：226001 南通

9、医学院附属医院参考文献1Weiner AJ, Kuo G, Brandley DW, et al. Detection of hepatitis C viral sequences in non-A non-B hepatitis. Lancet，1990, 335?1-3.2Takamizawa A, Moric C, Fuke I, et al. Structure and organization of hepatitis C virus genome isolated from human carriers. J Virol, 1991, 65?1105-1113.3王惠民，张冬雷，马达，等.二重RT-PCR同时检测HGV与HCV RNA.临床检验杂志,