HPLC_ELSD测定黄芪中黄芪甲苷含量及相关试验条件选择的探讨

1、药材生产与质量HPLC-ELSD测定黄芪中黄芪甲苷含量及相关试验条件选择的探讨马艳蓉1,刘泓2,柴国林3,张莅峡2(1.浙江大学药学系,浙江杭州310031;2.中国中医研究院基础理论研究所,北京100700;3.浙江亚克药业有限公司,浙江杭州310053摘要:目的探讨高效液相色谱-蒸发光散射法(HP LC-ELSD测定黄芪中黄芪甲苷含量中相关试验条件:如提取溶剂,溶剂浓度,提取方法及药材粉碎度等的最佳选择。方法采用HPL C-EL SD发光散射检测法。结果黄芪甲苷在2.010.0L g与峰面积积分值呈良好的线性关系。(r=0.9997,n=5,平均回收率为97.9%(RSD=1.8%。结论在

2、合适条件下,HP L C-EL SD测定黄芪中黄芪甲苷含量是一值得推广的方法。关键词:黄芪;黄芪甲苷;HPL C-EL SD;条件试验中图分类号:R284.1文献标识码:A文章编号:1004-2199(200306-0017-03黄芪为常用中药,具补气固表,托疮生肌,利水等功效,其药用价值较高,现代药理学研究表明,黄芪甲苷为其主要活性成分之一,在黄芪药材以及含黄芪复方制剂中通常选为定量指标成份。中国药典2000年版规定以豆科植物蒙古黄芪A stragalu membranaceus(FischBg e.var.mongholicus (BgeH siao或膜荚黄芪A.M embr anaceu

3、s(Fisch Bg e.的干燥根供药用。以往测定黄芪甲苷的方法主要有比色法、薄层扫描法(TLCS1,2、(HPLC-UV3以及近几年采用的HPLC-ELSD47。目前大多采用TLCS法为中国药典2000年版法定方法,近期国家药品监督局下发国家药品标准修订批件,对“黄芪注射液含量测定将T LCS法改为HPLC-ELSD法测定6”,较好地解决了TLCS法的操作烦琐、干扰较大及重现性差等不足。首次确立HPLC-ELSD法作为国家法定标准在中药质量监测中的应用。而HPLC-U V法虽然有所应用,但因黄芪甲苷紫外最大吸收波长为200.8nm,且紫外吸收较弱,溶剂背景难以消除。而HPLC-ELSD法解决

4、了T LCS及HPLC-U V法的局限性,得以在实践中很好应用。但目前见到的HPLC-ELSD法参考文献,对黄芪中黄芪甲苷相关提取试验条件未作详尽的比较研究,本文在实验中参照文献方法进一步补充和完善,相信对含黄芪药材及相关制剂中应用HPLC-ELSD法提供参考依据。1仪器与试药1.1仪器HP1100高效液相色谱仪,Alltech500型蒸发光散射检测器,HP3395积分仪,HGA-2000空气发生器,Rheodyne7725I进样阀,Hamilton25L l微量进样器,CX-1超声波清洗器。1.2试药黄芪甲苷对照品(中国药品生物制品检定所;黄芪药材及饮片1,2,3,4,5经谢宗万教授鉴定为蒙

5、古黄芪A str agalu membranaceus(FischBg e.v ar. mongholicus(Bg e.Hsiao。乙腈为色谱纯,(南开大学精细化学实验厂,其它试剂为分析纯,水为高纯水。2方法与结果2.1色谱条件色谱柱为YWGC18(10L m,4.6m m×200 m m;流动相:乙腈-水(12;室温,流速0.8mlm in-1;ELSD参数:漂移管温度:107;气体流速: 2.7mlmin-1。2.2供试品制备方法条件考察2.2.1提取溶媒的种类及浓度选择文献报道4以甲醇为提取溶媒,我们考察了不同种溶媒甲醇、乙醇及水提取,结果显示黄芪甲苷单纯水提取率比单17现代

6、中药研究与实践2003年第17卷第6期Resear ch and Pr actice of Chinese M edicines纯甲醇或乙醇提取率高,进一步比较不同浓度甲醇和乙醇提取所含黄芪甲苷提取率,相应不同浓度甲醇较乙醇及水偏高,以甲醇、60%甲醇、40%甲醇及水提取率分别为0.12、0.20、0.22、0.15m gg-1生药,以40%甲醇最高。以选择40%甲醇提取为最佳选择。2.2.2黄芪药材粗粉过筛目数选择将黄芪药材粗粉分别过20、40及60目筛提取结果分别为(0.24、0.27、0.35mgg-1随目数加大,递增。以60目提取率最高,因黄芪本身粗纤维较多,不宜过更高目数筛,选择以过

7、60目筛为妥。2.2.3提取方法选择考察冷浸24h后沙氏提取器、单纯冷浸24h及超声提取三种方式,提取率分别为0.35、0.21、0.087mgg-1,结果以冷浸24h 后用沙氏提取器提取率最高。2.2.4过D101大孔树脂柱洗脱液考察按文献4水洗脱40%醇洗脱70%醇洗脱方法,经考察,发现40%醇洗脱液中将除去带走部分极性大的杂质外,同时黄芪甲苷成份携带走近30%,而常温水洗脱液中,将大部分水溶性杂质带走,损失可忽略,对保护色谱柱有利,因此实验中,将40%醇洗脱步骤删除,保留水和70%乙醇洗脱。2.3供试品溶液的制备,本品经粉碎为粗品,过60目筛,精密称取1.5g,置索氏提取器中,加40%甲

8、醇20ml冷浸过夜,再续加40%甲醇使之总量为50 ml,热回流4h,提取液蒸干,残渣加水10ml微热溶解,加水饱和正丁醇振摇提取3次,每次20ml,合并正丁醇液,用氨试液洗2次,每次20ml,弃去氨液,正丁醇蒸干,残渣加水5m l,使溶解,放冷。通过D101大孔树脂柱(1.5cm×12cm,50m l水洗脱, 70%乙醇50ml洗脱,收集70%洗脱液,蒸干,甲醇溶解,并定容至2m l容量瓶中,经0.45L m微孔滤膜过滤后,作为供试品溶液。2.4线性关系的考察精密称定黄芪甲苷对照品10mg,加甲醇溶解并容至10ml容量瓶中,精密吸取2,4,6,8,10L l进样,以进样量(自然对数

9、为横坐标,峰面积积分值(自然对数为纵坐标,线性回归方程Y=1.5210X +12.1663,r=0.9997,进样量在210L g呈良好线性关系。2.5精密度实验精密吸取同一份样品20L l,重复进样6次, R SD2.3%。2.6重复性实验同一份样品按制备方法平行制备5份,含量平均值为0.36mgg-1生药,R SD为1.9%。2.7稳定性实验按照样品测定项下进行,对同一份样品,先后在0,1,2,4,8h进行测定,计算R SD1.2%。2.8回收率测定采用加样回收率测定法。取已知含量的样品约0.75g,精密加入黄芪甲苷对照品溶液0.0500m g ml-110ml(按11加入。按上述供试品样

10、品制备及色谱条件测定。测定结果见表1。表1回收率测定结果序号样品量mg测得量mg回收率%x%RS D%10.48010.968997.7620.47820.976199.5830.50140.988797.4697.9 1.840.49650.972895.2650.48990.988399.682.9样品测定,见表2。表2不同样品测定结果序号样品产地、提供单位含量(m gg-1外观性状特征1蒙古黄芪内蒙海南亚洲药厂0.64绵性大、柴性小、甜度高、发粘2蒙古黄芪内蒙(三年生北京同仁医院眼科所0.19柴性大、空心3蒙古黄芪内蒙北京同仁医院眼科所0.36柴性略小、粘性略大4蒙古黄芪山西(一年生北京

11、同仁医院眼科所0.17柴性大、纤维化强5蒙古黄芪饮片北京购北京同仁医院眼科所0.073潮湿(测水份含量13.0%、柴性大、纤维化强3讨论3.1曾试验甲醇水不同比例(7525,(4060及乙腈-水等不同比例流动相,确认参考文献1乙腈-水(23或(12,达基线分离、分离良好,乙腈比例加大黄芪甲苷相对保留时间减少,因此仍以乙腈-水(12出峰保留时间适度,尚可节省时间,节省有机溶媒,达到有效分离。3.2按ELSD检测器设置要求计算并确定漂浮管温度为107、气体流速为2.7Lmin-1,流速过高或过低会直接影响信噪比,温度过高或过低直接影18现代中药研究与实践2003年第17卷第6期Resear ch

12、and Pr actice of Chinese M edicines响溶剂的挥发程度,否则将会影响基线的稳定性,应严格遵循仪器设置要求,可适当调整。3.3有关计算问题,曾用同一组数据,用常规计算法、自然对数及常用对数法计算结果,前者线性关系不好,用后二者无显著区别。3.4HPLC-ELSD 法,操作简便,且不受外界环境干扰,试剂在检测中全部蒸发,灵敏度稳定性及重现性很高,确定是一种值得推广应用的检测黄芪及相关制剂中黄芪甲苷成份的最新而适用的方法。3.5样品测试结果,其含量高低与药材外观形状有一定相关性,绵性大,柴性小,发粘含黄芪甲苷较高;柴性大纤维性强,含量低;饮片经炮制处理,含水量较高,含

13、量偏低是否在加工中造成成分损失之故,有待进一步探讨。参考文献1王宝王王木.中成药质量标准物质研究M .北京:中国医药科技出版社,1994.538.2付铁军,李伯刚,及元乔,等.HPLC 法测定黄芪注射液中黄芪甲苷的含量J .天然产物的研究与发展,1997,9(4:53.3国家药典委员会.中国药典(一部S .2000.249.4周春玲,鲁静.高效液相色谱蒸发光散射检测测定黄芪中黄芪甲苷的含量J .中国中药杂志,2000,25(3:66.5田南卉,杨国红,张鲲,等.HPL C ELSD 检测测定黄芪和制剂中黄芪甲苷含量M ,迪马公司,蒸发光散射检测器应用文献和技术参考,2001.6邓海银.HPLC

14、 仪器的通用质量检测器蒸发光散射检测器(EL SDJ ,药物分析,1994,14(3:61.7国家药品监督管理局.国家药品标准修订批件,2001年ZFBO 171.(收稿日期:2003-09-27Assays of Astragaloside in Radix Astragali by HPLC -ELED andStudies on Its Choosing of the Condition TestMA Yan -r ong 1,LIU Hong 2,ZHANG Li -x ia 2,CHAI Guo -lin3(1.Pharmacy School,Zhejiang U niv ersit

15、y ,Hang zhou 310031,China;2.Institute of Basic Theory of T CM ,China Academ y of Tr aditio nal Chinese M edicine,Beijing 100700,China ;3.Zhejiang Yake Pharmaceutical Co .,Ltd .,Hangzhou 310053,China Abstract :Objective To study the HPLC-ELED m ethod for the assay s of astrag aloside in Radix Astrag

16、ali and determine the most suitable testing condition such as choosed solvent ,concentration o f the so lvent ,the w ay of the ex tr action and the g ranularity o f the raw m aterial ,etc .Method The HPLC -ELSD metho d w as used.Result The standard curve w as linear at the range of 2.010.0L g fo r a

17、strag alo side (r =0.9997,n =5,the average reco very was 97.9%(RS D =1.8%.Conclusion U nder suitable condition,the method of determ ining astragaloside in Radix Astragali by HPLC -ELED is w or th to be po pularized .Key words :Radix Astragali ;astrag aloside ;HPLC -ELED ;condition test封面介绍上海华宇药业有限公司简介上海华宇药业有限公司是目前国内最大的中药材生产经营企业之一,是由中国药材集团公司和上海市药材有限公