列当中苯乙醇苷类成分的含量测定

1、列当中苯乙醇苷类成分的含量测定 Orobanche caerulescens is an important medicinal resource in Orobanchaceae. The present study aims to establish methods for determination of acteoside，crenatoside ， and total phenylethanoid glycosides in O. caerulescens and determine the content in 15 samples to evaluate the resource

2、 utilization of this medicinal plant. The content of acteoside and crenatoside were quantitatively determined by HPLC， while totalphenylpropanoid glycosides was estimated by UV-VIS spectrophotometry. According to the results， the content of acteosidewas the highest in O. caerulescens ， followed by c

3、renatoside. The contents of acteoside ， crenatoside ， and total phenylethanoid glycosides were between 1.15%-15.60%， 0.83%-4.47% ， and6.78%-27.43% ， respectively ， which had significant differences. The acquisition time has great influence on the content of main components of O. caerulescens. The co

4、ntent of phenylethanoid glycosides is higher in the samples which were collected at the flowering stage. The two determination methods were proved to be simple ， accurate and reliable ， and can be used to evaluate the quality and resource utilization of O. caerulescens.doi ： 10.4268/cjcmm20212119列当

5、Orobanche caerulescens Steph. 为列当科列当属药用 植物， 别名紫花列当、兔子拐棍、独根草，为寄生草本，内蒙古 自治区各地分 布，东北、华北、西北等地也有分布 1-2 。列当 全草药用，有补肾助 阳、强筋骨、润肠的成效，主治阳痿、腰腿 冷痛、神经官能症及小儿腹 泄等，外用可消肿。蒙药名为特木根 - 苏乐，主治炭疽 3-4 。列当是 列当科重要的药用植物，国内外 学者的研究说明苯乙醇苷类化合物是其 特征性化学成分 5-7 。 苯乙醇苷类化合物 ( phenylethanoid glycosides ) ，是由一个 C-6-C-3 单元衍生出的取代苯乙醇为苷元的苷， 特

6、点是与苯乙醇 成苷的中心葡萄糖常被芳香酰基取代， 通常为咖啡酰 基取代， 因 此，也被称为咖啡酸酯类 ( caffeoyl esters ) 。苯乙醇苷类 化 合物也是列当科著名中药肉苁蓉的主要成分 8-10 ，具有抗氧 化、 去除自由基、神经保护、增强学习记忆、抗病毒、强心等明 显的生理活 性 11 。目前国内外关于列当中化学成分的含量测定未见报道。 课题 组的 研究说明毛蕊花糖苷和 crenatoside 是列当中含量最高的 苯乙醇苷类化 合物。文献报道毛蕊花糖苷具有很强的生理活性， 主要包括增强学习记 忆、抗骨质疏松、肝脏保护、杀菌、免疫、 补肾壮阳、抗氧化、抗衰老 等多种药理活性 12

7、-19 。有关 crenatoside 药理活性的研究相对较少， 仅发现其具有去除 DPPH ( 1-二苯基 -2- 三硝基苯肼)的活性，表现出显著的抗氧化作用。本研究分别建立了高效液相色谱法测定列当中毛蕊花糖苷和 crenatoside以及紫外分光光度法测定总苯乙醇苷类化合物 含量的方法，采集内蒙古 各地 15 批样品并进行测定，结果说明 2 种测定方法可用于列当药材的 质量控制，为其资源的进一步开 发利用提供了科学依据。 1 材料1.1 仪器UltiMate 3000 型高效液相色谱仪 DAD 佥测器，四元梯度 泵，在 线脱气机， 自动进样器， chromeleon 色谱工作站， Ther

8、mo Fisher ； TU-1901 双光束紫外 -可见分光光度计北京普析通 用仪器公司 ； AL240 分析天平 梅特勒 -托利多仪器厂 ；KQ-500DE 超声仪 昆山市 超声仪器厂。1.2 试剂毛蕊花糖苷和 crenatoside 为实验室自制，经 MS H1- 和 C13-NMR 确定结构， HPLC 峰面积归一化法测得纯度均大于 98% 乙腈 美国 Fisher 公司，色谱纯，水为娃哈哈纯洁水，其他 均为分析纯。1.3 药材 列当药材为内蒙古各地采集， 经内蒙古医科大学王素巍 讲师 鉴定为列当 O. coerulescens 的全草。2 方法与结果2.1 HPLC 测定毛蕊花糖苷和

9、 crenatoside 的含量2.1.1 色谱条件 Inertsil ODS-RP HPLC 色谱柱 4.6 mmX 250 mm 5 u m;流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液22 :78;检测波长为330 nm柱温30 C；流速1 mL?min-1,进样量10 u L,色谱图见图 1。2.1.2 对照品溶液制备 取减压枯燥至恒重的对照品适量，分别精密称定，参加甲醇溶解制成每 1 mL 含毛蕊花糖苷 0.52 mg crenatoside 0.53 mg的对照品溶液 A B, 精密吸取 A B 对照品溶液各 1.0 mL , 置 5 mL 量瓶中，甲醇定容，制备成混合对照品溶液G 保存于 4

10、 C 的冰箱，备用。2.1.3 供试品溶液制备 列当粉末过 40 目筛约 0.1 g , 精密称定，置具塞锥形瓶中，精密参加 70 卿醇溶液 25 mL , 称 定质量，浸泡 1 h 后，超声功率 500 W, 频率 40 kHz 提取 30 min , 冷却后补足失重 , 摇匀 , 静置 , 滤过 , 取续滤液即得。2.1.4 线性关系考察 分别精密吸取混合对照品 C 溶液 1,2,5, 10, 20, 30 u L 以及单一对照品 A 溶液 10, 12, 16 u L 注 入液相 色谱仪，测定，以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘 制标准曲线， 计算回归方程。结果说明毛蕊花糖苷在 0.1

11、04 ?8.320 u g 线性关系良好， 回归方程为 Y=20.056X-0.483 , r=0.999 9 ; crenatoside 在 0.106 ? 3.180 u g 线性关系良好， 回归方程为 Y=20.182 X+0.025 , r=1.000 0 。2.1.5 精密度试验 精密吸取供试品溶液 , 连续进样 6 次, 记录色谱 峰面积。结果毛蕊花糖苷， crenatoside 峰面积的 RSD 分别是 0.23% ， 0.39% ，说明仪器精密度良好。2.1.6 重复性试验 取同一份供试样品粉末 6 份，精密称定， 按2.1.3 项下方法平行制备供试品溶液， 连续进样， 记录色

12、谱峰 面积。 结果毛蕊花糖苷、 crenatoside 峰面积的 RSD 分别为 1.0%, 1.3% ，表 明该方法重复性良好。2.1.7 稳定性试验 精密吸取同一份供试品溶液，分别在样 品制备 后的 0, 2, 4, 6, 8 h 内进样 5 次，记录色谱峰面积。结 果毛蕊花糖苷、 crenatoside 峰面积的 RSD 分别为 0.28%, 0.69% 。 说明供试品溶液在 8 h 内稳定性良好。2.1.8 加样回收率试验 取含量的列当样品表 3, 12 号粉末毛蕊花糖苷 99.2 mg?g-1 , crenatoside 29.7 mg?g-1 9 份， 每份约 0.05 g , 精

13、密称定，分别按该样品中待测成分含量的 80%, 100% , 120% , 精密参加 2 个对照品适量 , 按 2.1.3 项下 方法 制备供试品溶液 , 进样测定并计算各成分平均加样回收率及 RSD 见表 12.1.9 样品含量测定 按 2.1.3 项下方法制备供试品溶液， 分别精密吸取混合对照品溶液与供试品溶液各10 卩 L, 注入液相色谱仪，记录峰面积并计算 2 种成分的含量，见表 2。2.2 紫外分光光度法测定总苯乙醇苷的含量2.2.1 毛蕊花糖苷对照品溶液制备 精密称取毛蕊花糖苷对照品 10.7 mg 用 70%甲醇溶解并定容于 50 mL 量瓶中，得到 0.214 g?L-1 的标

14、准溶液。2.2.2 供试品溶液制备 取列当粉末约 0.1 g ，精密称定， 置于 100 mL 锥形瓶中，精密参加 70%甲醇 25 mL 称重，室温浸 泡 1 h ， 超声提取 40 min ，补足失重，过滤，精密吸取滤液 0.5 mL 置于 25 mL 量瓶中，用 70% 甲醇定容，即得。2.2.3 最大吸收波长选择 分别吸取适量对照品溶液和供试 品溶液 于 25 mL 量瓶中，用 70% 甲醇定容，以 70% 甲醇为空白对 照，于 200 ? 500 nm 波长范围内扫描，在 332 nm 处得到最大吸 收波长，选择 332nm 为测定波长，见图 22.2.4 线性关系考察 分别精密吸取

15、毛蕊花糖苷标准溶液0.5 , 1.0 , 1.5 , 2.0 , 2.5 , 3.0 mL 置于 25 mL 量瓶中，并用 70% 甲 醇定容，以 70%甲醇为空白对照，在 332 nm 处测定吸光度 A。 结果 说明毛蕊花糖苷对照品在 4.28? 25.68 卩 g?mL-1 内线性关 系良好，回归方程为 Y =0.033 1X + 0.000 1， r=0.999 8 。2.2.5 重复性试验 精密称取 6 份列当粉末各约 0.1 g ，按2.2.2 项下方法平行制备供试品溶液 6 份，测定总苯乙醇苷含量， RSD 为 2.2% ，说明本方法重复性良好。2.2.6 精密度试验 取同一供试品

16、溶液，连续 6 次测定其在332 nm 处吸光度，计算得 RSD0.21% ，结果说明该方法精密度良 好。2.2.7 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别于 0，1, 2, 4, 8, 12 h 在332 nm 处进行紫外测定， RSD 为1.1% 。表 明供 试品溶液在 12 h 内稳定性良好。2.2.8 加样回收率试验 取含量的列当样品表 3， 12号粉末9份n=3,各约0.05 g，精密称定，分别按总 苯乙醇苷 含量的 80%， 100% ， 120% 3 个水平参加毛蕊花糖苷对 照品，按 222 项下方法制备供试品溶液，在 332 nm 处测定吸 光度，计算平均回收率 和 RSD 见表

17、3。2.2.9 总苯乙醇苷含量测定 按 2.2.2 项下制备供试品溶 液，以 70% 甲醇为空白对照，在 332 nm 处测定吸光度，并采用 标准曲线法计算含 量，结果见表 2。3 结论 列当中的主要成分是苯乙醇苷类成分，包括毛蕊花糖苷、 cren atoside 、异毛蕊花糖苷、和口 camp neoside 等，其中含量 最 高的 2 个成分是毛蕊花糖苷和 crenatoside 。通过对 15 个批次不同采集地点以及不同采收时间的列当中 苯乙醇苷成分的含量测定结果说明，毛蕊花糖苷、 crenatoside 和总苯 乙醇苷的含量差异较大。毛蕊花糖苷的质量分数在1.15% ? 15.60%

18、样品 10 含量低于线性范围， cren atoside 在 0.83% ? 4.47% ，总苯乙醇苷在 6.78% ? 27.43% 。研究中发现内 蒙古东、中、 西部不同地区产的药材的含量变化不是很明显。影 响药材中苯乙醇苷成 分含量的主要因素是采集时间。传统认为， 列当药材应在 6 月份盛花 期采集， 质量好，研究亦证实了这一点， 有的药材采集于盛花期， 其 总苷和毛蕊花糖苷含量极高， 超出线 性检测范围。样品 2， 6， 7， 10， 14， 15 采集时几乎在 8 月 份，地上局部已全部枯萎，药材颜 色发黑，其苯乙醇苷类成分含 量较低。4 讨论本研究建立了 HPLC 同时测定列当中毛蕊花糖苷和crenatoside 的方法，方法简便、准确且重复性好，为系统评价 列当的 质量提供科学依据。 在方法建立过程中， 对成分的检测波 长，色谱流 动相条件、流速、柱温以及苯乙醇苷类成分的提取条 件都做了考察，确 定流动相为乙腈 -0.1% 磷酸水溶液 22 : 78; 检测波长为 330 nm 柱温30 C;流速1 mL?min-1;进样量10卩L,在这个色谱条件下，毛蕊花糖苷、crenatoside 能到达很好的基 线别离；且进样量分别在 0.104 ? 8.32 卩 g ( r=0.999 9 ) 0.106 ? 3.18 卩 g ( r=1.000 0