抗HBs-HBsAg复合物诱生体液免疫应答的研究

1、抗HBs-HBsAg复合物诱生体液免疫应答的研究    周生华瞿涤闻玉梅何祥昆郭盛淇 【 摘要 】目的研究抗HBs-HBsAg复合物在BALB/c小鼠诱生体液免疫应答的特点。 方法分别用鼠抗HBs-HBsAg免疫原性复合物(IC)或单独HBsAg免疫BALB/c小鼠(加或不加氢氧化铝)，分析其诱生的抗HBs IgG效价及IgG亚类。 结果用IC加氢氧化铝为佐剂免疫小鼠诱生的抗HBs中以IgG1亚类为主，而用HBsAg免疫鼠则以IgG2b亚类较高。IC不加氢氧化铝佐剂诱生的抗HBs中IgG1及IgG2a均高于单独HBsAg免疫鼠。研究还显示，抗HBs Ig

2、G Fc段是巨噬细胞(M)等抗原提呈细胞摄取IC的主要途径。 结论抗HBs-HBsAg复合物免疫诱生的体液免疫应答较单独HBsAg免疫强。抗HBs主要通过Fc段的介导作用，改变了机体抗原提呈细胞对HBsAg的摄取、加工及抗原提呈，并可增强HBsAg的免疫原性。 【 主题词 】抗原-抗体复合物乙型肝炎表面抗原IgG巨噬细胞 Humoral immune responses induced by anti-HBs-HBsAg immunogenic complexes (IC) in BALB/c mice Zhou Shenghua*, Qu Di,Wen Yumei,et al.*Depart

3、ment of Molecular Virology, Shanghai Medical University,Shanghai 200032 【 Abstract 】Objective To study the anti-HBs IgG and IgG subclasses induced by anti-HBs-HBsAg immunogenic complexes in BALB/c mice. Methods Mouse anti-HBs-HBsAg complexes or goat anti-HBs-HBsAg complexes were separately used to i

4、mmunize BALB/c mice,and the mice were boostered with IC or HBsAg alone three weeks later .ELISA assay was used to detect the anti-HBs-IgG and IgG subclasses. Results Immunization employing mouse anti-HBs-HBsAg complexes adsorbed to alum resulted in predominantly IgG1 response,whereas without adjuvan

5、t,both IgG1 and IgG2a antibodies were higher than those induced by HBsAg alone.Data also indicated that the Fc fragment of anti-HBs IgG was necessary for increased uptake of anti-HBs-HBsAg complexes by antigen-presenting cells. ConclusionsMouse anti-HBs-HBsAg complexes induced stronger humoral immun

6、e responses in BALB/c mice than that did by HBsAg alone. The Fc fragment of anti-HBs mediated changes in uptake,processing and presentation of HBsAg by APC,which may increase the immunogenicity of HBsAg. 【 Subject words 】 Antigen-antibody complex HBsAgIgGMacrophage 本室在乙肝的治疗性疫苗研究中，曾构建人抗HBs-HBsAg免疫原性复

7、合物(IC)，在BALB/c小鼠显示人抗HBs对HBsAg的免疫原性有增强作用，并首先提出可将该种免疫原性复合物作为慢性乙肝的治疗性疫苗1，然而人抗HBs与抗原组成的复合物在小鼠体内仅起聚集抗原颗粒的作用，并无通过种特异的Fc受体介导的作用。本课题利用多克隆鼠抗HBs构建IC，在鼠体内研究抗HBs Fc段对腹腔M摄取IC的影响及诱生的抗HBs效价及IgG亚类。 材料和方法 1.主要试剂：HBsAg为自血源纯化的HBsAg，含量220g/ml。鼠抗HBs自制。羊抗鼠IgG亚类-HRP抗体为上海生物制品研究所产品。125I抗-HBs多克隆抗体作为HBsAg定量检测试剂(北京原子能研究所产品)。胃蛋

8、白酶用于消化IgG Fc段(中科院上海东风制药厂产品)。Sephadex G-100为Pharmacia公司产品。 2.动物：BALB/c小鼠，雌性，68周龄，购于中科院上海实验动物饲养中心。 3.鼠抗HBs-HBsAg复合物制备：按本室常规制备，即取适量HBsAg加入适量鼠抗HBs，并加入0.01mol/L pH7.2 PBS,于37孵育30分钟，置4 1618小时，以8000r/min 离心10分钟，取上清测定游离抗原及抗体，以抗原略过量作为组建抗原-抗体复合物的合适比例标准。 4.去除抗HBs Fc 段及其抗HBs F(ab)2-HBsAg复合物制备：根据文献2。利用胃蛋白酶消化鼠抗-H

9、Bs以去除其Fc段，即取经硫酸铵初步纯化的鼠抗HBs IgG 15mg 加入0.5mg胃蛋白酶，再补充0.1mol/L pH4.0的醋酸钠，于37水浴消化1824小时，以1mol/L氢氧化钠调pH至8.0。经Sephadex G-100柱纯化，收集第一峰即为抗-HBs F(ab)2段，经透析、浓缩后用于制备抗HBs F(ab)2-HBsAg复合物。复合物按本室常规方法制备，以测定上清游离HBsAg作为判断抗原抗体结合比例指标。同时对抗HBs F(ab)2-HBsAg复合物负染后进行电镜观察。 5.腹腔M制备及对抗HBs F(ab)2-HBsAg复合物摄取：按前文所述3， 每只 BALB/c 小

10、鼠注射含 Con A 100g的Hanks液1ml (3只小鼠)， 第3天收集腹腔洗液，将3只小鼠腹腔洗液细胞混合培养于24孔板，于37 5% CO2 孵育2小时后洗去悬浮细胞。每孔加入IC或HBsAg(含3g HBsAg),孵育2小时，收集上清，洗涤细胞3次，以除去胞外游离HBsAg或IC，并收集第3次洗涤上清，另以含NP-40的细胞裂解液裂解细胞，收集裂解细胞上清，5000 r/min离心5分钟去除细胞残片，利用125I抗-HBs多克隆抗体测定培养上清及细胞裂解液上清中HBsAg含量， 结果以CPM均值±s表示。 6.免疫BALB/c小鼠：分别用抗HBs-HBsAg或单独HBsA

11、g与等量氢氧化铝(alum)佐剂混合，经小鼠后腿胫前肌注射，100l/只；每组4只小鼠(将小鼠随机分组)，每只小鼠注射含1g HBsAg的IC或单独HBsAg。第一次免疫后3周，以同样剂量加强免疫一次，3周后采血测定抗HBs。另外，为研究alum对IC诱生体液免疫应答的影响，以等量生理盐水代替alum与IC或单独HBsAg混合后免疫小鼠。 7.抗HBs IgG及IgG亚类分析：利用ELISA方法测定抗HBs及IgG亚类。在包被HBsAg的检测孔中加入待测血清，37孵育1小时，加入羊抗鼠IgG-HRP或羊抗鼠IgG亚类-HRP，孵育、洗涤后，加底物显色，在492nm波长测A值(吸光度值)。 结果

12、 1.不同种属抗HBs对HBsAg免疫原性的影响：为研究种属特异性抗HBs Fc段在体内增强HBsAg的免疫原性的介导作用。分别用鼠抗HBs或羊抗HBs构建IC并经腹腔免疫BALB/c小鼠(含HBsAg 1g,并加alum)。结果显示(图1)，鼠源抗HBs能较明显地增强HBsAg的免疫原性，而羊抗HBs仅有较低度的增强作用。 图1鼠或羊抗-HBs IC(加氢氧化铝佐剂)诱生BALB/c小鼠抗-HBs      Fig 1. The anti-HBs induced by goat or mouse anti-HBs IC (with alum)in BA

13、LB/c mice 胃蛋白酶消化去除抗HBs IgG Fc段后，用常规检测抗HBs的方法不能检出抗HBs(抗HBs未经消化对照A492=1.412,胃蛋白酶消化后A492=0.084).由于保留抗HBs F(ab)2段，仍能够聚集HBsAg颗粒，见图2电镜照片所示。 2.抗HBs F(ab)2-HBsAg复合物的制备及腹腔M对其摄取率：如附表所示，经胃蛋白酶消化去除抗HBs Fc段后，与完整抗HBs构建的IC相比，腹腔M对抗HBs F(ab)2-HBsAg复合物摄取率明显减少。但M对该复合物摄取量仍然明显多于单纯HBsAg组(P0.05)。 图2去除HBs IgG Fc段后的IC电镜图形(A)

14、，单纯HBsAG(B) Fig 2. The anti-HBs F(ab)2 -HBsAg complexes examed by EM(A),HBsAg alone(B)×135000 附表腹腔M体外摄取抗HBs F(ab)2 -HBsAg复合物及单纯HBsAg的比较 Table . Uptake of the complexes of anti-HBs F(ab)2 -HBsAg and HBsAg alone by M in vitro Before incubation Incubated 2 hours later Supernatant after washing thr

15、ee times Cell lysate (%#) P value* F(ab)2 -IC 4023±689* 1861±955 262±53 660±65(26.2) 0.05 Anti-HBs-IC 3986±1335 1291±13 445±78 2836±578(68.7) 0.01 HBsAg 25787±5108 26149±706 288±16 411±55(1.5) :Though the concentration of HBsAg used in each

16、 group was identical,due to complexed to either anti-HBs or F(ab)2 of anti-HBs,the CPM of HBsAg assayed by labelled anti-HBs before incubation was different *:CPM(HBsAg)*:Compared with HBsAg #:Percentage=CPM of cell lysate/(CPM of supernatant+CPM of cell lysate)×100 3.鼠抗HBs-HBsAg免疫BALB/c小鼠诱生的抗H

17、Bs IgG效价及亚类分析：由于IgG1及IgG2a亚类可分别反映小鼠TH2或TH1细胞诱导激活的免疫应答类型，因而常作为反映小鼠体液免疫或细胞免疫应答的指标之一4。图3显示，IC诱生的抗HBs总IgG及IgG1均高于用单纯HBsAg免疫鼠(P0.05),而单纯HBsAg免疫鼠的IgG2b高于IC组。两者诱生的IgG2a及IgG3均较低。在不加氢氧化铝佐剂时(图4)，虽然产生的抗HBs效价较低，但IC诱生的抗HBs IgG中IgG1、IgG2a及IgG2b均高于相应的HBsAg免疫鼠(P0.05，IgG3均较低，结果未示)。结果提示，氢氧化铝佐剂不利于机体B细胞合成IgG2a,可能与该佐剂不利

18、于激活TH1细胞有关。 图3IC与单独HBsAg诱生BLAB/c小鼠抗HBs效价及亚类 Fig 3. anti-HBs IgG subclasses induced by IC and HBsAg adsorbed to alum Note:Four mice/group 图4IC与单独HBsAg免疫(不加alum)诱生的抗HBs IgG亚类 Fig 4. The anti-HBs IgG subclasses induced by IC and HBsAg alone without alum Note:1. * A value 2.5,2.Four mice/group 讨论 与细胞免疫相

19、似，抗体在免疫网络中既是免疫的效应因子，又是调控因子5。本文研究了抗HBs作为调控因子对HBsAg的免疫原性的调控效应。 前曾报道小鼠腹腔M、脾脏及骨髓树突状细胞(DC)体外摄取IC的量明显多于单纯抗原3；反映抗HBs可能主要通过以下两种途径增加机体抗原提呈细胞(APC)对IC的摄取量：(1)抗HBs IgG可通过Fc段与APC膜上的Fc受体交联结合而大量摄入IC；(2)通过抗HBs对HBsAg的聚集作用，形成较大颗粒，易被APC内化摄入。我们利用胃蛋白酶消化去除鼠抗HBs IgG Fc片段，结果腹腔M摄入该IC的量明显降低，但仍然比单纯HBsAg摄入量高。结果证明抗HBs IgG增强机体AP

20、C对HBsAg摄取主要通过Fc段对APC膜上的Fc受体的交联作用，而抗HBs的聚集只起次要作用。 为在体内进一步研究Fc受体介导的免疫原性增强作用，分别用羊抗HBs或鼠抗HBs组建IC并免疫BALB/c小鼠，结果表明，同种属动物血清抗HBs更有助于增强HBsAg的免疫原性，也说明Fc段在抗HBs增强HBsAg免疫原性中具有重要作用。同种动物血清抗HBs IgG不仅能够通过Fab段对HBsAg聚集，而且还可通过Fc段的介导作用，增强机体APC对HBsAg的摄取、加工和提呈，以诱生更强的免疫应答；而异种动物血清抗HBs对HBsAg仅起聚集作用。Fc受体广泛分布于APC等免疫效应细胞表面，抗体通过与

21、Fc受体结合，能够介导免疫效应细胞对抗原的摄取等作用，参与对抗原诱生的免疫应答调节作用。APC细胞被激活而摄入大量颗粒性抗原异物，不仅可增强依赖抗体的细胞杀伤活性(ADCC作用)，而且还可使激活的M等APC通过分泌IL-1、IL-12等细胞因子调节机体免疫应答，并增强对T细胞应答的剌激作用6。进一步研究将可全面揭示抗HBs对HBsAg免疫原性的调控作用。 Alum作为目前国内外普遍应用的佐剂，已发现其可显著增强体液免疫应答(抗体)水平，但主要诱导IgG1类抗体(即TH2型应答)。近年有报道，alum可抑制TH1型应答，致T细胞杀伤性应答的CTL活性降低7。为此，本文工作在研究IC与单独HBsA

22、g诱生小鼠抗HBs IgG亚类差异的同时，比较了alum对抗体亚类的影响。结果显示，与alum混合后免疫，IC诱生的抗HBs IgG1高于HBsAg免疫鼠，而IgG2a相差不明显；不加alum时，IC诱生的抗HBs IgG中IgG1及IgG2a均高于HBsAg免疫鼠，可能与alum不利于诱导B细胞合成IgG2a的抑制作用有关。本文体液免疫研究结果与本室曾发现IC诱生的细胞因子种类相符3。虽然小鼠体内诱生的免疫应答不一定与人体完全相同，但根据实验结果，今后在使用预防性或治疗性疫苗时，应有选择地使用佐剂，以分别激活TH1或TH2细胞类型免疫应答，适应不同的预防或临床治疗需要。 本课本受国家863高

23、科技计划资助(102-07-01-01) 作者单位：200032 上海医科大学卫生部分子病毒学实验室周生华(博士生)，瞿涤，闻玉梅；卫生部上海生物制品研究所(何祥昆，郭盛湛) 参考文献 1闻玉梅.治疗性疫苗的研究进展.中华微生物学和免疫学杂志，1996，16155-158. 2刘彦仿.免疫组织化学.北京：人民卫生出版社，1990，25.      3周生华，闻玉梅.乙型肝炎病毒表面抗原抗体复合物对抗原的加工、提呈与诱生细胞因子的作用.病毒学报，1997，3269-272. 4Pertmer TM,Roberts TR,Haynes JR.Influenza virus nucleoprotein-specific immunoglobulin G subclass and cytokine responses