反相高效液相色谱测定动物源食品中大观霉素残留

1、                  作者：苑丽 胡功政 肖传斌 梁军 李奎 司红彬【摘要】  目的 建立反相高效液相色谱法配合电化学检测器测定动物源食品中大观霉素残留。方法 用三氯乙酸匀浆抽提以脱去试样中的蛋白，然后用二氯甲烷去除试样中的脂溶性物质，再经LCSCX阳离子固相萃取小柱净化处理，产物进行检测。流动相为离子对缓冲体系(0.02mol/L柠檬酸0.004mol/L庚烷磺酸钠，50% NaOH调pH至6.10)

2、乙腈(体积比为92.57.5)，流速0.6ml/min，工作电极电压1.0V，柱温35，检测波长254nm。结果 大观霉素在0.0110.0g/ml范围内线性关系良好，相关系数R=0.99998。结论 该法简便、直接、准确。 【关键词】  反相高效液相色谱 电化学检测器 大观霉素 残留    Determination of spectinomycin residues in animal food by RPHPLC     ABSTRACT  Objective  A reversedpha

3、se high performance liquid chromatography (RPHPLC) method with electrochemical detector was established for the determination of spectinomycin residues in animal food.Methods  The samples were deproteinized by trichloroacetic acid, and the fatty soluble substances were extracted with dichlorome

4、thane. Followed by cleanedup on a LCSCX positive ion solidphase extraction column, then the extracts were determined. The mobile phase was citric acid ionpair buffer solution (0.02mol/L citric acid0.004mol/L sodium heptanesulfonate, the pH adjusted to 6.10 by 50% NaOH)acetonitrile (92.57.5, V/V). Th

5、e flow rate was 0.6ml/min, the working electrode voltage was 1.0V, the column temperature was maintained at 35, and the detection wavelength was at UV 254nm.  Results  The linear relationship of the peak and concentration of spectinomycin was determined as 0.0110.0g/ml, with a regression c

6、oefficient of 0.99998.  Conclusions  The method is simple, direct,and accurate.    KEY WORDS  RPHPLC;  Electrochemical detector;  Spectinomycin;  Residues     大观霉素(spectinomycin，曾译壮观霉素)是氨基糖苷类抗生素，主要通过作用于细菌核糖体30S亚基来抑制其蛋白质的合成，对革兰阴性菌(如大肠埃希

7、菌、沙门菌、布鲁菌、变形菌、铜绿假单胞菌、巴氏杆菌等)有较强作用，对革兰阳性菌和支原体亦有一定作用。我国兽药典兽药使用指南(化学药品卷，2005版)1及美国FDA均规定本品在牛、羊、猪、鸡等食用组织中最高允许残留量分别为：肌肉：500g/kg；脂肪、肝：2000g/kg和肾：5000g/kg。国外一些学者建立了各种HPLC法26来检测动物源食品中本品的残留，但大观霉素无紫外吸收，必须形成紫外可见光或荧光化合物后才能进行HPLC分析7，8，即必须先进行衍化生成相应的衍化物。迄今为止，所有这些方法即缺乏必要的灵敏度，亦有繁杂的衍化过程，难以推广应用。1994年美国农业部又建立微生物学方法来检测本品

8、在食品中的残留，但其灵敏度也低，且缺乏特异性。Elrod等9发现大观霉素具有电化学活性，发展了一种使用离子对色谱电化学检测器的方法测定大观霉素，但并未用该法测定生物样品。Schermerhorn等10报道用带有电化学检测器的HPLC来检测牛奶中的大观霉素残留。我国进出口商品检疫局1997年发布了出口肉及肉制品中大观霉素残留检测的HPLC电化学法，测定方法灵敏度高，但样品提取步骤繁杂，不适用于脂肪组织，其净化过程系用活性炭制柱，处理后的待检液中的杂质仍干扰测定结果。本方法采用三氯乙酸抽提去除样品中的蛋白、二氯甲烷去除试样中脂溶性物质，经LCSCX阳离子固相萃取小柱净化处理，再用反相高效液相色谱配

9、合电化学检测器直接检测动物源食品中残留的大观霉素，结果表明，本方法简单、直接，且回收率、检测限和准确度均可达到相关标准。    1  仪器和试药    1.1  仪器    带515泵、2465电化学检测器的高效液相色谱仪(美国Waters公司)、电子天平(感量0.0001g)、高速组织捣碎机、回旋式振荡器、高速冷冻离心机和Supelclean LCSCX SPE阳离子固相萃取小柱(500mg/3ml，含碳量14%)。    1.2  试药

10、60;   大观霉素为山东鲁抗生产，含量不少于99.0%；乙腈(色谱纯，Baker公司)，庚烷磺酸钠(色谱纯，Sigma公司)；水为色谱级超纯水(采用Millipore公司纯水系统自制)；带一个结晶水的柠檬酸、甲醇、氢氧化钠、氯化钠、三氯乙酸和二氯甲烷均为分析纯试剂。    2  方法与结果    2.1  色谱条件    色谱柱：C18柱(瑞典AKZO NOBEL Kromasi C18，250mm×4.6mm，5m)；保护柱(LabALLianceTM

11、 C18)；流动相为柠檬酸离子对缓冲体系(0.2mol/L柠檬酸0.004mol/L庚烷磺酸钠，50% NaOH调pH至6.10)乙腈(体积比为92.57.5)，流速为0.6ml/min，工作电极电压1.0V，柱温35，检测波长254nm，进样量20l，分离结果见图1。    2.2  标准曲线的绘制    准确称取大观霉素0.0298g，加水溶解并定容为100ml，配成浓度为200g/ml的储备液(按有效量计)，置4冰箱中保存，一周内用完。临用前， 取此储    图1  &

12、#160; 大观霉素标准溶液的高效液相色谱图(20g/ml)备液用纯水稀释成0.01、0.02、0.05、0.25、0.5、1.0、2.0、5.0和10.0g/ml浓度的大观霉素标准溶液，在“2.1”色谱条件下进样，经电化学检测器检测，按其所得峰面积与对应的标准液浓度作标准曲线，并计算回归方程为：    A=0.75468+16.53266C  R=0.999976    表明大观霉素在0.0110.0g/ml范围内线性关系良好。    2.3  样品处理  

13、60; 2.3.1  抽提  称取(15g±0.05g)试样，转至一个50ml的离心管中，加入12ml超纯水，在1800r/min条件下用高速组织捣碎机捣1min，取粘稠液18g加50%三氯乙酸2ml和二氯甲烷10ml，在回旋式振荡器上高速振摇30min。然后在4 3800RCFRCF=0.0000118×R×N2，R为离心半径(cm)，N为转速(r/min)条件下离心30min，取上清10ml，加二氯甲烷2ml，在回旋加速器上振荡混合20min，再在4 12000RCF条件下离心30min，上清液即为药物的抽提液。  &#

14、160; 2.3.2  净化  采用LCSCX阳离子固相萃取小柱净化。首先LCSCX小柱用甲醛活化，再用纯水平衡后，将经“2.3.1”法制得的备用液过柱，起始2ml弃去，收集随后3ml，经水性滤膜(0.45m)过滤，滤液供HPLC测定。对肌肉和脂肪内本药的残留测定，可取“2.3.1”法制得的抽提液直接过0.45m水性滤膜即可。-     The paper shows that flavanones are abundant in longan nucleuses. It is significant to make full use of l

15、ongan necleuses. It has a brilliant prospect in developing this natural resources. 【参考文献】  1Cai Changhe, Tang Xiaolang,Zhang Aiyu, etc. longan fruit pulp nutritional therapy value and its development application prospectJ. Food Science, 2002, 23 (8): 328.2Xu Jiankai. Longan high production

16、 technology question and answerM. Guangzhou: Guangdong Science and Technology Publishing Press,2001:56.3Tan Shuhui, Zhan Reting. Chinese medicine open country recognition handbook (2)M. Guangzhou: Guangdong Science and Technology Publishing Press,2004:208.4Nanjing college of pharmacy << Chines

17、e medicine study >> compilation group Chinese medicine study (center book) M. Nanjing:Jiangsu People's Publishing Press,1976:628.5Xiao Gengsheng, Huang Ruqiang,Ceng Qingxiao,etc. Nutrition composition of Longan seedsJ.Food Science and Technology,2004,(1):93.6Xia Xingzhou, Zhang Hui, Wei Chuanwan. In the banyan tree leaf the flavonoid withdraw