外源基因的表达

1、重组重组DNA技术操作的主要步骤技术操作的主要步骤生化教研室生化教研室 陈新美陈新美载体载体质粒质粒噬菌体噬菌体病毒病毒目的基因（外源基因）目的基因（外源基因）基因组基因组DNA cDNA 人工合成人工合成PCR产物产物限制酶消化限制酶消化开环载体开环载体DNA目的基目的基因因连接酶连接酶重组体重组体转化转化体外包装，转染体外包装，转染带重组体的宿主带重组体的宿主筛选筛选表型筛选表型筛选酶切电泳鉴定酶切电泳鉴定菌落原位杂交菌落原位杂交一、重组一、重组DNADNA分子的导入分子的导入选定的受体细胞应具备的条件：选定的受体细胞应具备的条件：1. 1. 易于接纳重组易于接纳重组DNADNA分子导入；

2、分子导入；2.2.对载体的复制、扩增和表达无严格限制；对载体的复制、扩增和表达无严格限制；3.3.不存在特异性降解外源不存在特异性降解外源DNADNA的酶系统；不对外源的酶系统；不对外源DNADNA进行修饰；能表达重组体分子所提供的某种表进行修饰；能表达重组体分子所提供的某种表型特征。型特征。常用的导入方法常用的导入方法: : （一）转化（一）转化（transformationtransformation）（二）转染（二）转染（transfectiontransfection）（三）感染（三）感染（infectioninfection）第六节第六节 重组重组DNA分子的导入和筛选与鉴定分子的导

3、入和筛选与鉴定1.氯化钙法：氯化钙法：细菌处于低温、细菌处于低温、低渗低渗CaCl2溶液中，菌细胞溶液中，菌细胞壁通透性增加，菌体膨胀成壁通透性增加，菌体膨胀成球形，经短暂热休克后重组球形，经短暂热休克后重组DNA易进入易进入2.电穿孔法：电穿孔法：除特殊仪器外除特殊仪器外比氯化钙法更简单，使用时比氯化钙法更简单，使用时注意电场强度、电脉冲长度、注意电场强度、电脉冲长度、DNA浓度等参数。浓度等参数。（一）转化（一）转化（transformationtransformation）（二）转染（二）转染 将表达载体导入真核细胞的过程将表达载体导入真核细胞的过程方法：方法： 1、磷酸钙转染、磷酸钙转

4、染 2、二乙氨乙基、二乙氨乙基DEAE葡聚糖介导转染葡聚糖介导转染 3、电穿电穿孔孔 :操作简单且转染效率高，几乎可转染任何细胞用于瞬时表达或稳定表达。但是它需要专门仪器，确定最佳实验条件。 4、脂质体转染、脂质体转染 :脂质体（liposomes）是一种人造类脂膜.用脂质体包裹DNA，瞬时表达和稳定表达，操作简单，转染效率高，重复性好，且毒性低、包装容量大，昂贵。 5、显微注射显微注射:转染效率高，但需要一定的仪器和操作技巧,主要用于稳定表达。（三）感染（三）感染（infectioninfection）感染是指以人工改造的噬菌体或病毒为载体构建感染是指以人工改造的噬菌体或病毒为载体构建的重组

5、体的重组体DNA，经体外包装成具有感染性的噬菌体颗，经体外包装成具有感染性的噬菌体颗粒和病毒颗粒后，借助噬菌体或病毒的外壳蛋白将重粒和病毒颗粒后，借助噬菌体或病毒的外壳蛋白将重组组DNA注入细菌或真核细胞。注入细菌或真核细胞。感染的效率很高，但重组体感染的效率很高，但重组体DNA需经过较为复杂需经过较为复杂的体外包装过程。的体外包装过程。与转染不同，也可以以质粒的方式进入苏竹君，与转染不同，也可以以质粒的方式进入苏竹君，并进行复制繁殖。并进行复制繁殖。第四节第四节 常用载体常用载体 定义定义 载体是携带目的基因进入宿主细胞扩增和载体是携带目的基因进入宿主细胞扩增和表达的工具。表达的工具。具备的

6、条件具备的条件:具有自主复制能力具有自主复制能力有多个单一限制性内切酶的酶切位点（有多个单一限制性内切酶的酶切位点（MCS）具有选择性遗传标记具有选择性遗传标记分子量小分子量小拷贝数高（拷贝数高（10个个200个个/细胞）细胞）具有较高的遗传稳定性。具有较高的遗传稳定性。 常用载体常用载体:质粒质粒DNA噬菌体噬菌体DNA病毒病毒DNA质粒质粒 (plasmid):是细菌内携带的染色体外是细菌内携带的染色体外的小型双链环状的小型双链环状DNADNA，能独立进行复制。，能独立进行复制。质粒载体特点质粒载体特点: 1.分子量相对较小能在细菌内稳定存在，能分子量相对较小能在细菌内稳定存在，能在宿主细

7、胞内独立自主复制；有较高的拷在宿主细胞内独立自主复制；有较高的拷贝数。贝数。 2.具有一个以上的遗传标志，便于在宿主细具有一个以上的遗传标志，便于在宿主细胞进行选择。胞进行选择。 3.具有多个限制性酶的单一切口，称为多克具有多个限制性酶的单一切口，称为多克隆位点。便于外源基因的插入。隆位点。便于外源基因的插入。常用质粒载体常用质粒载体（一）（一） pBR322质粒：由一系列大肠杆菌质粒质粒：由一系列大肠杆菌质粒DNA通过重组技术构建成，长度为通过重组技术构建成，长度为4.36kb，特点：，特点：（1）含有复制起始点和复制调节信号；）含有复制起始点和复制调节信号；（2）有单个）有单个EcoRI酶

8、切位点，可切开插入目的基因；酶切位点，可切开插入目的基因；（3）有抗四环素基因）有抗四环素基因Ter+和抗氨苄青霉素基因和抗氨苄青霉素基因 Amp+，便于，便于重组体细胞的筛选。重组体细胞的筛选。（二）（二） pUC系列载体系列载体:由由pBR质粒与质粒与M13噬菌体构建而成，长度为噬菌体构建而成，长度为2.674kb。pUC载体系列已成为载体系列已成为pBR322的替代载体，是基因重组中应用较的替代载体，是基因重组中应用较普遍的质粒载体。普遍的质粒载体。 特点：特点：具有更小的分子量和更高的拷贝数。具有更小的分子量和更高的拷贝数。 “蓝白斑蓝白斑”筛选筛选: pUC载体中的载体中的LacZ

9、基因可编码基因可编码-半乳糖苷半乳糖苷酶（酶（-Gal）N端的端的-肽链，该肽链，该-肽与宿主细胞肽与宿主细胞(如如E.coli JM109）中）中F 因子上的因子上的LacZ M15基因（基因（-肽缺陷型）的产肽缺陷型）的产物互补，产生完整的、有活性的物互补，产生完整的、有活性的-半乳糖苷酶，分解生色底半乳糖苷酶，分解生色底物（物（X-gal）形成蓝色菌落。当外源基因插入）形成蓝色菌落。当外源基因插入MCS后，后，LacZ -肽基因的读码框被破坏，不能合成完整的肽基因的读码框被破坏，不能合成完整的-半乳糖苷半乳糖苷酶分解底物酶分解底物X-gal，菌落呈白色。称为，菌落呈白色。称为“蓝白斑蓝白

10、斑”筛选。筛选。EcoRSacKpnSmaBamHXbaSalPstSphHind pUC19(2 686bp)AmprLacZ Oriori pUC19质粒载体图 根据根据-半乳糖苷酶显色反应筛选半乳糖苷酶显色反应筛选 :AmN2H（三）其它质粒载体1能在体外转录克隆基因的质粒载体 此类载体是由pUC系列质粒载体派生而来的，它们与pUC载体之间的主要差别是带有来自噬菌体带有来自噬菌体T7、SP6的启动子，的启动子，这些启动子为这些启动子为RNA聚合酶的聚合酶的附着作用提供了特异性的识别位点，使载体能在附着作用提供了特异性的识别位点，使载体能在体外转录插入的外源体外转录插入的外源DNA。 如，

11、pGEM-3Z/4Z是由pUC18/19改造而来，大小为2.74kb，序列结构几乎与pUC18/19完全一样。与pUC18/19相比，pGEM-3Z/4Z在MCS的两端添加了SP6和T7噬菌体的启动子。而pGEM-3Z/4Z之间的差别仅在于SP6和T7两个启动子的位置互换、取向相反而已。2穿梭质粒载体（shuttle plasmid vector） 是一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择标记，因而可在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。 这类质粒载体可以携带着外源DNA序列在不同物种的细胞之间，特别是在原核和真在原核和真核细胞之间往返穿梭，核细胞之间往返穿梭，因此在基因工程的研究中

12、是非常有用的。（四）T-A克隆载体 此类载体是专为克隆PCR产物而设计的，它们的共同点是在其多克隆位点两侧的3末端携带有未配对的T碱基。由于许多耐热的DNA聚合酶（如Taq、Tth等）扩增时都有在PCR产物3末端加上A碱基的特性，因此在连接酶的作用下可直接将PCR产物插入到T-A载体中。 T-A克隆载体的突出优点是克隆载体的突出优点是能直接克隆能直接克隆PCR产物产物，获取、连接外源获取、连接外源DNA不受酶切位点的限制，不受酶切位点的限制，近年来得到非常广泛的应用，已有不同公司推出具有各自特点的T-A克隆载体系列。 二、噬菌体载体二、噬菌体载体 噬菌体（bacteriophage，简称pha

13、ge）是一类细菌病毒，可用于克隆和扩增特定的DNA片段，是广泛使用的基因克隆载体。（一）噬菌体载体1噬菌体的特点 噬菌体的基因组为线状双链DNA，全长48 502bp，由左右两臂组成，共含有66个基因，线性DNA分子的两端为12碱基组成的彼此完全互补的5单链突出黏性末端，称为cos位点。注入到感染寄主细胞内的线性DNA分子，会借助cos位点互补连接形成环状双链结构，按方式及滚环方式复制。 噬菌体感染细菌后，可进入溶菌生命周期及溶源生命周期。溶菌性生长是噬菌体基因组晚期基因表达，大量复制噬菌体DNA，并包装成病毒颗粒，通过裂解宿主细胞而释放出来的生长方式，这一方式可使噬菌体克隆外源噬菌体克隆外源

14、DNA后大量复制。后大量复制。溶源性生长是噬菌体只表达早期基因，通过与宿主染色体DNA重组、整合，随宿主染色体的复制而复制，在宿主细胞内只有一个噬菌体基因组DNA拷贝。2噬菌体载体的构建 噬菌体是最早发展和使用的基因工程载体，以溶菌方式生长。 与质粒载体相比，其突出优点是：可插入较大外源DNA片段（可达23kb）；噬菌体的感染效率远高于质粒载体的转化效率。（二）粘粒载体（二）粘粒载体 虽然用噬菌体作为载体最大能容纳23kb的外源DNA片段，但是有些基因可达35kb40kb或更大，同时在分析基因组结构时，还要了解相连锁的基因及基因排列的顺序，这就要求克隆更大的DNA片段。 粘粒是由质粒和由质粒和

15、噬菌体的噬菌体的cos黏性末端构黏性末端构建而成建而成。可作为克隆大片段基因组DNA的一种载体。目前已发展出许多不同类型的粘粒载体，大体具有以下的结构与特点： 1含有DNA的cos黏性末端及与噬菌体包装有关的短序列 在噬菌体的生活周期中，通过cos端位的突出单链相互补，可将许多个DNA串联在一起，若两个cos位点相距35kb45kb，则能被包装酶系识别并切断而包装成病毒颗粒。 2含有质粒的抗药性标记（如Ampr基因）和自主复制成分 具有质粒的复制子，因此当体外重组的粘粒分子包装成病毒颗粒感染细菌后，可按质粒方式在细菌中进行复、扩增。而粘粒载体上所携带的抗药性基因，可作为重组体分子的筛选标记。

16、3具有一个或多个单一切口的限制性内切酶位点 用于插入外源DNA片段。 4粘粒分子小 如pJB8为5.4kb，所以可插入大片段的外源DNA（可达45kb），对多基因家族组织结构的研究很有用。 5某些粘粒若接上能在真核细胞生活的元件（如SV40复制区及启动子）及选择标记，便可作为穿梭载体在真核细胞中生存及表达。（三）M13噬菌体载体 M13是一种丝状单链噬菌体，基因组全长6 407bp，为闭环单链闭环单链DNA。M13只能感染具有F伞毛的雄性大肠杆菌，在细菌内复制时形成双链DNA，这种复制型（replication form，RF）M13相当于质粒，可用作基因克隆载体。当RF的M13在细菌内达到1

17、00个200个拷贝后，M13只合成单链DNA，经包装成噬菌体颗粒而分泌至细胞外。 利用利用RF的的M13作为载体插入外源作为载体插入外源DNA，使其在细，使其在细菌内产生单链菌内产生单链DNA，以进行，以进行DNA序列分析、体外序列分析、体外定点突变和核酸杂交等。定点突变和核酸杂交等。 通过对M13噬菌体进行改造，已成功构建了M13mp系列载体，如M13mp8/9、M13mp10/11及M13mp18/19等。它们都含有LacZ基因，并在其中插入了MCS序列。 M13mp系列载体大多是成对的，且有pUC质粒系列的MCS与之相对应。需注意的是，M13噬菌体载体克隆的外源DNA片段不宜大于1 50

18、0bp，这就限制了这类载体在基因克隆中的应用。 为解决这一问题，研究者们已发展出一类由质粒载体和单链噬菌体载体结合而成的新型载体系列，称为噬菌粒（phagemid），如pUC118/119噬菌粒载体。三、人工染色体载体三、人工染色体载体 人工染色体载体是为了克隆更大的DNA片段以及建立真核生物染色体物理图和进行序列分析等的需要而发展起来的一类新型载体。酵母人工染色体载体（yeast artificial chromosome vector，YAC） 是第一个成功构建的人工染色体载体，用于在酵母细胞中克隆大片段外源DNA。 YAC由酵母染色体、酵母2m DNA质粒的复制起始序列等元件衍生而成，主

19、要包括以下调控元件：着丝粒（centromere，CEN），以保证染色体在细胞分裂过程中正确地分配到子代细胞；端粒（telomere，TEL），作为染色体复制所必需的成分，可防止染色体被核酸外切酶降解而缩短；复制起始点和限制性酶切位点；YAC载体的两臂均带有选择标记；原核序列及调控元件，包括大肠杆菌复制起始点、Ampr基因等，以便于在大肠杆菌中操作。细菌人工染色体载体（bacterial artificial chromosome vector，BAC） 是继YAC之后的又一人工染色体载体，是以细菌的F因子（一种特殊质粒）为基础构建而成的，可插入100kb300kb的外源DNA片段。与YAC相

20、比，具有克隆稳定、易与宿主DNA分离等优点。BAC是人类基因组计划中基因序列分析用的主要载体。 此外，噬菌体P1衍生的人体染色体（PAC）和哺乳动物人工染色体（MAC）也在不断发展中。四、病毒载体四、病毒载体 近年来为适应真核细胞DNA重组技术的需要，特别是为实现真核基因表达或基因治疗的需要为实现真核基因表达或基因治疗的需要，已发展了用动物病毒（如SV40、牛乳头瘤病毒、腺病毒及反转录病毒等）改造的病毒载体及用于昆虫细胞表达的杆状病毒载体等。 目前常用的病毒载体有两类：整合型和游离型。目前常用的病毒载体有两类：整合型和游离型。整合型载体可整合到宿主细胞的染色体上，并随染色体的复制而复制，可持续

21、表达外源基因，但存在插入诱变的危险。游离型载体并不整合到宿主染色体DNA上，而是游离于染色体外瞬时表达外源基因，有较好的安全性。 （一）反转录病毒载体（一）反转录病毒载体 反转录病毒为单正链RNA病毒，可高效感染许多类型的宿主细胞，并稳定整合到宿主细胞染色体上，是最先被改造且应用最为广泛的基因治疗载体。 （二）腺病毒载体（二）腺病毒载体 腺病毒是无包膜的线性双链DNA病毒，基因组长约36kb，两端各有一个反向末端重复区（inverted terminal repeat，ITR），为病毒复制和包装所必需。基因组由早期转录域（分布着四个转录单位E1、E2、E3、E4，承担调节功能）、晚期转录域（负

22、责结构蛋白的编码）和RNA聚合酶转录子组成。 （三）感染（三）感染（infectioninfection）感染是指以人工改造的噬菌体或病毒为载体构建感染是指以人工改造的噬菌体或病毒为载体构建的重组体的重组体DNA，经体外包装成具有感染性的噬菌体颗，经体外包装成具有感染性的噬菌体颗粒和病毒颗粒后，借助噬菌体或病毒的外壳蛋白将重粒和病毒颗粒后，借助噬菌体或病毒的外壳蛋白将重组组DNA注入细菌或真核细胞。注入细菌或真核细胞。感染的效率很高，但重组体感染的效率很高，但重组体DNA需经过较为复杂需经过较为复杂的体外包装过程。的体外包装过程。与转染不同，也可以以质粒的方式进入宿主菌，与转染不同，也可以以质

23、粒的方式进入宿主菌，并进行复制繁殖。并进行复制繁殖。( (一）根据重组载体的遗传表型进行筛选一）根据重组载体的遗传表型进行筛选 1 1根据载体的抗药性标记筛选根据载体的抗药性标记筛选 2 2根据载体的抗药性标记插入失活选择根据载体的抗药性标记插入失活选择 3 3根据根据-半乳糖苷酶显色反应筛选半乳糖苷酶显色反应筛选 4 4根据插入的外源基因性状进行筛选根据插入的外源基因性状进行筛选（二）限制性核酸内切酶酶切鉴定（二）限制性核酸内切酶酶切鉴定（三）核酸分子杂交法（三）核酸分子杂交法（四）（四）PCR法法（五）免疫化学检测法（五）免疫化学检测法：二二. 重组体的筛选与鉴定重组体的筛选与鉴定1.抗抗

24、药药性性标标记记选选择择（一）根据重组载体的遗传表型进行筛选（一）根据重组载体的遗传表型进行筛选BamH酶切酶切目的目的DNA重组质粒重组质粒转化转化大肠杆菌大肠杆菌含含Amp平板平板BamH酶切酶切DNA连接酶连接酶重组体重组体TetrTetrAmprAmpr含含Amp和和Tet平板平板转化转化大肠杆菌大肠杆菌AmprTetrBamH位点位点BamH酶切酶切BamH酶切酶切DNA连接酶连接酶目的目的DNA重组质粒重组质粒大肠杆菌大肠杆菌含含Amp平板平板含含Amp平板平板含含Tet平板平板 2.抗抗药药性性标标记记插插入入失失活活选选择择含含Amp平板平板3根据根据-半乳糖苷酶显色反应筛选半

25、乳糖苷酶显色反应筛选 :AmN2H4根据插入的外源基因性状进行筛选根据插入的外源基因性状进行筛选如把酵母基因组如把酵母基因组DNA随机切割后插入到随机切割后插入到质粒载体中，然后将重组质粒转化到质粒载体中，然后将重组质粒转化到组氨酸组氨酸缺陷型大肠杆菌缺陷型大肠杆菌细胞中，并在无组氨酸的培细胞中，并在无组氨酸的培养基中培养。这样只有含酵母组氨酸基因并养基中培养。这样只有含酵母组氨酸基因并获得表达的转化菌获得表达的转化菌才能在无组氨酸的培养基才能在无组氨酸的培养基中生长中生长。（二）（二）.限制性核酸内切酶酶切鉴定限制性核酸内切酶酶切鉴定（三）（三）. .核酸分子杂交法核酸分子杂交法: :（四）

26、（四）PCR法法 某些载体的某些载体的MCS两侧存在保守的序列，如两侧存在保守的序列，如pGEM系列载体的系列载体的MCS两侧是两侧是T7及及SP6启启动子序列，可根据此序列设计引物，对提动子序列，可根据此序列设计引物，对提取的重组质粒进行取的重组质粒进行PCR扩增。扩增。 如果已知目的基因的全序列或其两端的序如果已知目的基因的全序列或其两端的序列与全长，可设计合成一对引物，以转化列与全长，可设计合成一对引物，以转化菌的质粒菌的质粒DNA为模板进行为模板进行PCR扩增，扩增，若若PCR产物与目的基因的预期长度相一致，产物与目的基因的预期长度相一致，那么即可初步筛选出含重组体的阳性菌落。那么即可

27、初步筛选出含重组体的阳性菌落。鸡的鸡的肌球蛋白的克隆和检出肌球蛋白的克隆和检出ACTGAAGGCT基因表达基因表达是指结构基因在调控序列的作用下转录成是指结构基因在调控序列的作用下转录成mRNA，经加工后在核糖体的协助下又转译出相应的基因，经加工后在核糖体的协助下又转译出相应的基因产物产物蛋白质，再在受体细胞环境中经修饰而显示出相蛋白质，再在受体细胞环境中经修饰而显示出相应的功能。应的功能。从基因到有功能的产物这整个转录、转译及所从基因到有功能的产物这整个转录、转译及所有的加工过程就是基因表达的过程，它是在一系列酶和调有的加工过程就是基因表达的过程，它是在一系列酶和调控序列的共同作用下完成的。

28、控序列的共同作用下完成的。基因重组的基因重组的主要目的主要目的是要使目的基因在某一细胞中能是要使目的基因在某一细胞中能得到高效表达，即产生人们所需要的高产目的的基因产物，得到高效表达，即产生人们所需要的高产目的的基因产物，如蛋白质、多肽类生物药物。如蛋白质、多肽类生物药物。重组重组DNA技术的技术的核心核心是是基因表达技术基因表达技术。 外源基因的表达设计目的基因的外源基因的表达设计目的基因的克隆、复制、转录、翻译、蛋白克隆、复制、转录、翻译、蛋白产物的加工及分离纯化等过程。产物的加工及分离纯化等过程。 表达体系分为原核表达系统和真表达体系分为原核表达系统和真核表达系统。核表达系统。目前已构建

29、出了多种基因表达系统，包括原核生物表达系目前已构建出了多种基因表达系统，包括原核生物表达系统和真核生物表达系统，不同的表达系统具有各自的特点。统和真核生物表达系统，不同的表达系统具有各自的特点。在原核生物中，基因表达是以在原核生物中，基因表达是以操纵子操纵子的形式进行的。当操的形式进行的。当操纵子的调节基因与纵子的调节基因与RNA聚合酶作用时，结构基因则开始转录成聚合酶作用时，结构基因则开始转录成相应的相应的mRNA，与此同时，与此同时， mRNA立即与核糖体结合转译出相立即与核糖体结合转译出相应的多肽或蛋白质，转录完毕时转译也完成，随之应的多肽或蛋白质，转录完毕时转译也完成，随之mRNA也被

30、也被水解掉。水解掉。在真核生物基因表达系统中，转录是在核内进行的，先生在真核生物基因表达系统中，转录是在核内进行的，先生成成hnRNA，再加工去掉内含子，外显子相连接，并修饰，再加工去掉内含子，外显子相连接，并修饰5和和3末端后才形成末端后才形成mRNA，而，而mRNA只能在细胞浆中的核糖体上转只能在细胞浆中的核糖体上转译成多肽或蛋白质，再经过加工、糖化、形成高级结构。译成多肽或蛋白质，再经过加工、糖化、形成高级结构。v基因表达在原核生物与真核生物中的差别？基因表达在原核生物与真核生物中的差别？外源基因表达系统外源基因表达系统外源基因表达系统：外源基因表达系统：泛指目的基因与表达载体重组后，导

31、入泛指目的基因与表达载体重组后，导入合适的受体细胞，并能在其中有效表达，产生目的基因产物合适的受体细胞，并能在其中有效表达，产生目的基因产物（目的蛋白）。（目的蛋白）。外源基因表达系统外源基因表达系统基因表达载体基因表达载体受体细胞受体细胞基因表达系统基因表达系统原核生物基因表达系统：原核生物基因表达系统：如大肠杆菌表达如大肠杆菌表达系统、系统、芽孢杆菌表达系统、链霉菌表达系芽孢杆菌表达系统、链霉菌表达系统、蓝藻表达系统等。统、蓝藻表达系统等。真核生物基因表达系统：真核生物基因表达系统：如酵母表达系如酵母表达系统统、植物细胞表达系统、昆虫细胞表达、植物细胞表达系统、昆虫细胞表达系统、系统、哺乳

32、动物细胞表达系统等。哺乳动物细胞表达系统等。v （一）原核生物作为基因表达系统的受体细（一）原核生物作为基因表达系统的受体细胞所具有的特点：胞所具有的特点：原核生物大多数为单细胞异养，生长快，代谢易于控制，可原核生物大多数为单细胞异养，生长快，代谢易于控制，可通过发酵迅速获得大量基因表达产物。通过发酵迅速获得大量基因表达产物。基因组结构简单，便于基因操作和分析。基因组结构简单，便于基因操作和分析。多数原核生物细胞内含有质粒或噬菌体，便于构建相应的表多数原核生物细胞内含有质粒或噬菌体，便于构建相应的表达载体。达载体。生理代谢途径及基因表达调控机制比较清楚。生理代谢途径及基因表达调控机制比较清楚。

33、不具备真核生物的蛋白质加工系统，表达产物无特定的空间不具备真核生物的蛋白质加工系统，表达产物无特定的空间构相。构相。内源蛋白酶会降解表达的外源蛋白，造成表达产物的不稳定。内源蛋白酶会降解表达的外源蛋白，造成表达产物的不稳定。一一. . 外源基因在原核细胞中的表达外源基因在原核细胞中的表达1 1、强启动子及两侧调控序列、终止序列、强启动子及两侧调控序列、终止序列2 2、含、含SDSD序列序列3 3、选择标志、选择标志4 4、多接头克隆位点、多接头克隆位点（三）外源基因在原核细胞中的表达（三）外源基因在原核细胞中的表达1 1融合型表达蛋白融合型表达蛋白 所谓融合型表达是指将外所谓融合型表达是指将外

34、源目的基因与另一基因相拼接构建成融合基因源目的基因与另一基因相拼接构建成融合基因进行表达。进行表达。2 2非融合型表达蛋白非融合型表达蛋白 3 3分泌型表达蛋白分泌型表达蛋白 利用分泌型表达载体，需利用分泌型表达载体，需要在信号肽的帮助下进行。要在信号肽的帮助下进行。4 4包涵体包涵体（二）原核表达载体（二）原核表达载体1融合型表达蛋白融合型表达蛋白融合蛋白融合蛋白将外源蛋白基因与受体菌自身蛋白基将外源蛋白基因与受体菌自身蛋白基因重组在一起，但不改变两个基因的阅读框，以这因重组在一起，但不改变两个基因的阅读框，以这种方式表达的蛋白称为融合蛋白。种方式表达的蛋白称为融合蛋白。*融合蛋白与单独表达

35、的外源蛋白相比具有以下优点：融合蛋白与单独表达的外源蛋白相比具有以下优点：稳定性好；稳定性好；表达效率高；表达效率高；较易于分离纯化。较易于分离纯化。寡聚型外源蛋白：寡聚型外源蛋白：在构建外源蛋白表达载体时，将多个外源目的在构建外源蛋白表达载体时，将多个外源目的蛋白基因串连在一起，克隆在质粒载体上，以这种蛋白基因串连在一起，克隆在质粒载体上，以这种方式表达的外源蛋白称为方式表达的外源蛋白称为寡聚型外源蛋白寡聚型外源蛋白。2非融合型表达蛋白非融合型表达蛋白整合型外源蛋白整合型外源蛋白将要表达的外源基因整合到染色体的将要表达的外源基因整合到染色体的非必需编码区非必需编码区上，上，使之成为染色体结构

36、的一部分而稳定地遗传，以此种方式表使之成为染色体结构的一部分而稳定地遗传，以此种方式表达的外源蛋白即为达的外源蛋白即为整合型外源蛋白整合型外源蛋白。为获得含整合基因的重组体，被选择的载体一般是那些在为获得含整合基因的重组体，被选择的载体一般是那些在受体细胞内不能自主复制或温度敏感型质粒。那么当外源基因受体细胞内不能自主复制或温度敏感型质粒。那么当外源基因被交换到染色体上后，由于宿主菌的不断分裂和增殖，细胞内被交换到染色体上后，由于宿主菌的不断分裂和增殖，细胞内的质粒逐渐被稀释直至消失。外源基因整合到染色体上后虽只的质粒逐渐被稀释直至消失。外源基因整合到染色体上后虽只含有单拷贝，但在合适的条件下

37、仍能高效表达外源蛋白。含有单拷贝，但在合适的条件下仍能高效表达外源蛋白。3、分泌型表达蛋白、分泌型表达蛋白外源基因的表达产物，通过运输或分泌的方式外源基因的表达产物，通过运输或分泌的方式穿过细胞的外膜进入培养基中，即为穿过细胞的外膜进入培养基中，即为分泌型外源表分泌型外源表达蛋白达蛋白。外源蛋白以分泌型蛋白表达时，须在外源蛋白以分泌型蛋白表达时，须在N端加入端加入1530个氨基酸组成的个氨基酸组成的信号肽（信号肽（signal peptides）序序列。信号肽列。信号肽N端的最初几个氨基酸为极性氨基酸，端的最初几个氨基酸为极性氨基酸，中间和后部为疏水氨基酸，它们对蛋白质分泌到细中间和后部为疏水

38、氨基酸，它们对蛋白质分泌到细胞膜外起决定性作用。当蛋白质分泌到位于大肠杆胞膜外起决定性作用。当蛋白质分泌到位于大肠杆菌细胞内膜与外膜之间的外周质时，信号肽被信号菌细胞内膜与外膜之间的外周质时，信号肽被信号肽酶所切割。肽酶所切割。分泌到细胞外周质的蛋白质产物较稳定，不易被分泌到细胞外周质的蛋白质产物较稳定，不易被细胞内蛋白酶所降解。细胞内蛋白酶所降解。简化了发酵后处理的纯化工艺。简化了发酵后处理的纯化工艺。缺点：缺点：外源蛋白分泌型表达通常产量不高，有时信外源蛋白分泌型表达通常产量不高，有时信号肽不被切割或在不适当的位置发生切割。号肽不被切割或在不适当的位置发生切割。以分泌型蛋白的形式表达外源基

39、因的优点：以分泌型蛋白的形式表达外源基因的优点：分泌型可能使蛋白质按适当的方式折叠，有利于分泌型可能使蛋白质按适当的方式折叠，有利于形成正确的空间构相，获得有较好生物学活性或免形成正确的空间构相，获得有较好生物学活性或免疫原性的蛋白质。甚至有些在细胞内表达时无活性疫原性的蛋白质。甚至有些在细胞内表达时无活性的蛋白质分泌后则有活性。的蛋白质分泌后则有活性。4、包涵体、包涵体包涵体包涵体：在一定条件下，外源基因的表达产：在一定条件下，外源基因的表达产物在大肠杆菌中积累并致密地集中在一起形物在大肠杆菌中积累并致密地集中在一起形成无膜的裸露结构，这种结构称为包涵体。成无膜的裸露结构，这种结构称为包涵体

40、。包涵体存在部位包涵体存在部位：细胞质、细胞周质：细胞质、细胞周质包涵体包涵体的组成的组成蛋白质蛋白质非蛋白质非蛋白质外源基因的表达产物：外源基因的表达产物：占大部分，具有正占大部分，具有正确的氨基酸序列，但空间构相错误，因而包涵确的氨基酸序列，但空间构相错误，因而包涵体蛋白一般体蛋白一般没有生物学活性没有生物学活性。受体细胞本身的表达产物：受体细胞本身的表达产物：如如RNA聚合聚合酶、核糖核蛋白、外膜蛋白以及表达载体编码酶、核糖核蛋白、外膜蛋白以及表达载体编码的蛋白等。的蛋白等。：包括包括DNA、RNA和脂多糖等和脂多糖等。包涵体形成的本质包涵体形成的本质是细胞内蛋白质的不断聚集，主要包括是

41、细胞内蛋白质的不断聚集，主要包括三个方面：三个方面：折叠状态的蛋白质的聚集作用；折叠状态的蛋白质的聚集作用；非折叠状态的蛋白质的聚集作用；非折叠状态的蛋白质的聚集作用；蛋白质折叠中间体的作用。蛋白质折叠中间体的作用。原核表达体系的不足：原核表达体系的不足：v不宜表达真核基因组不宜表达真核基因组DNA；v不能加工表达的真核蛋白质；不能加工表达的真核蛋白质；v表达的蛋白质常形成不溶性包涵体表达的蛋白质常形成不溶性包涵体(inclusion body) ；v很难表达大量可溶性蛋白很难表达大量可溶性蛋白 优点：优点：可表达克隆的可表达克隆的cDNA及真核基因组及真核基因组DNA 可适当修饰表达的蛋白质

42、可适当修饰表达的蛋白质 表达产物分区域积累表达产物分区域积累 缺点：缺点：操作技术难、费时、经济操作技术难、费时、经济（一）真核表达体系（酵母、昆虫、（一）真核表达体系（酵母、昆虫、乳类动物细胞等）乳类动物细胞等）二、外源基因在真核细胞中的表达二、外源基因在真核细胞中的表达（二）真核表达载体大多是穿梭载体（二）真核表达载体大多是穿梭载体, 通通常包括以下元件：常包括以下元件：1启动子启动子 包括包括SV40、CMV、RSV及及LTR等。等。2增强子增强子 3剪接信号剪接信号4终止信号和终止信号和PolyA化信号化信号5遗传选择标记遗传选择标记 ：胸苷激酶基因（：胸苷激酶基因（tk）、二氢叶）、

43、二氢叶酸还原酶基因（酸还原酶基因（dhfr）、氯霉素乙酰转移酶基因）、氯霉素乙酰转移酶基因（cat）、新霉素抗性基因（）、新霉素抗性基因（neor）等。）等。（三）外源基因导入宿主细胞（三）外源基因导入宿主细胞(转染或感染转染或感染)新霉素的类似物新霉素的类似物G418（geneticin）对真）对真核和原核细胞均有毒性。表达载体中携带的核和原核细胞均有毒性。表达载体中携带的neor基因编码的基因编码的磷酸转移酶磷酸转移酶能使能使G418失活，失活，所以当真核细胞中导入了含所以当真核细胞中导入了含neor基因的载体基因的载体后，转染细胞就后，转染细胞就可以在含有可以在含有G418的培养基中的培

44、养基中生长而得以筛选生长而得以筛选。该选择系统适用于所有真。该选择系统适用于所有真核细胞核细胞。v新霉素抗性选择系统新霉素抗性选择系统 （四）转染细胞的筛选（四）转染细胞的筛选酵母表达系统酵母表达系统:酵母（酵母（yeast）是一类以芽殖或裂殖进行无性繁殖的单细是一类以芽殖或裂殖进行无性繁殖的单细胞胞真核生物真核生物，是外源基因最理想的真核生物基因表达系统。，是外源基因最理想的真核生物基因表达系统。v酵母菌的特点：酵母菌的特点：基因表达调控的机制比较清楚，遗传操作相对简便，并于基因表达调控的机制比较清楚，遗传操作相对简便，并于1996年完成了对酿酒酵母基因组全序列的测定；年完成了对酿酒酵母基因

45、组全序列的测定；具有原核生物所不具备的蛋白质翻译后加工和修饰系统；具有原核生物所不具备的蛋白质翻译后加工和修饰系统；可将外源基因表达产物分泌到培养基中；可将外源基因表达产物分泌到培养基中；对人体和环境安全，不含毒素和特异性病毒；对人体和环境安全，不含毒素和特异性病毒；可进行大规模的发酵，工艺简单而成熟，成本低廉。可进行大规模的发酵，工艺简单而成熟，成本低廉。真核表达体系真核表达体系实例：实例：酵母、昆虫、乳类动物细胞等酵母、昆虫、乳类动物细胞等哺乳动物细胞基因表达系统哺乳动物细胞基因表达系统:哺乳动物细胞是最高等的真核生物细胞，其结构、功能哺乳动物细胞是最高等的真核生物细胞，其结构、功能和基因

46、表达调控更加复杂。要表达具有生物学功能的蛋白质和基因表达调控更加复杂。要表达具有生物学功能的蛋白质和具有特异性催化功能的酶，需要在高等真核生物细胞中进和具有特异性催化功能的酶，需要在高等真核生物细胞中进行。外源基因在哺乳动物细胞中的表达包括行。外源基因在哺乳动物细胞中的表达包括基因的转录、基因的转录、mRNA翻译及翻译后蛋白质加工翻译及翻译后蛋白质加工等过程。等过程。7.3.6.1 哺乳动物基因表达载体的组成特征哺乳动物基因表达载体的组成特征哺乳动物基因表达载体哺乳动物基因表达载体质粒载体质粒载体病毒载体病毒载体哺乳动物基因表达质粒载体是一类哺乳动物基因表达质粒载体是一类穿梭质粒穿梭质粒，能够

47、在，能够在细细菌菌（大肠杆菌）和（大肠杆菌）和哺乳动物细胞哺乳动物细胞中进行扩增。中进行扩增。哺乳动物基因表达宿主细胞哺乳动物基因表达宿主细胞 哺乳动物基因表达宿主细胞选择的哺乳动物基因表达宿主细胞选择的基本原则基本原则：来来源丰富、转化效率高、表达效果好。源丰富、转化效率高、表达效果好。在哺乳动物基因表达过程中，在哺乳动物基因表达过程中，与正常细胞生理特与正常细胞生理特性尽可能接近的肿瘤细胞性尽可能接近的肿瘤细胞常被选择为基因转移的受常被选择为基因转移的受体细胞。体细胞。目前用作哺乳动物基因表达系统的受体细胞主要目前用作哺乳动物基因表达系统的受体细胞主要有：有：CHO-K1细胞、细胞、COS

48、细胞、鼠骨髓瘤细胞细胞、鼠骨髓瘤细胞等。等。CHO-K1细胞细胞CHO-K1细胞是从中国仓鼠卵巢中分离出的一株上皮细胞。细胞是从中国仓鼠卵巢中分离出的一株上皮细胞。目前被用于基因表达的受体细胞是一株缺乏二氢叶酸还原酶目前被用于基因表达的受体细胞是一株缺乏二氢叶酸还原酶（dhfr）的突变株，它可在氨甲蝶呤选择压力下，使外源基因）的突变株，它可在氨甲蝶呤选择压力下，使外源基因拷贝数扩增并得到较高水平的表达，表达量可达拷贝数扩增并得到较高水平的表达，表达量可达10g/ml以上。以上。外源基因在没有选择压力的情况下能稳定保持；外源基因在没有选择压力的情况下能稳定保持；适合多种蛋白质的分泌表达和胞内表达

49、；适合多种蛋白质的分泌表达和胞内表达；对培养基的要求较低，可在无血清培养基中培养；对培养基的要求较低，可在无血清培养基中培养；细胞可进行贴壁培养，也可进行大规模悬浮培养。细胞可进行贴壁培养，也可进行大规模悬浮培养。该细胞株是目前应用该细胞株是目前应用最广泛最广泛的哺乳动物基因表达受体细胞的哺乳动物基因表达受体细胞之一，已有多种外源基因如人组织型纤溶酶原激活剂（之一，已有多种外源基因如人组织型纤溶酶原激活剂（tPA）、）、干扰素干扰素、干扰素、干扰素 、凝血因子、凝血因子等在等在CHO细胞中得到表达。细胞中得到表达。CHO-K1细胞特点细胞特点COS细胞细胞它来源于非洲绿猴肾细胞系（它来源于非洲

50、绿猴肾细胞系（CV-1），能组成性表达），能组成性表达SV40的大的大T抗原。抗原。COS细胞的特点：细胞的特点：细胞来源丰富；细胞来源丰富；细胞易于培养和转染；细胞易于培养和转染；能使转染到该细胞中的带有能使转染到该细胞中的带有SV40复制子复制子的转录载体快速扩增；的转录载体快速扩增；能瞬时大量表达外源基因的产物。能瞬时大量表达外源基因的产物。由于转染质粒在由于转染质粒在COS细胞中无节制复制，最终将导致细细胞中无节制复制，最终将导致细胞无法忍受而死亡。利用胞无法忍受而死亡。利用COS细胞作为外源基因瞬时表达的细胞作为外源基因瞬时表达的受体细胞可广泛用于哺乳动物基因的表达与调控、蛋白结构受体细胞可广泛用于哺乳动物基因的表达与调控、蛋白结构与功能分析等研究。与功能分析等研究。鼠骨髓瘤细胞鼠骨髓瘤细胞鼠骨髓瘤细胞如鼠骨髓瘤细胞如Sp2/0、NSO和和J558L等已被用作基因表等已被用作基因表达的受体细胞。目前已有免疫球蛋白（达的受体细胞。目前已有免疫球蛋白（Ig）、）、tPA等多种外等多种外源基因在鼠骨髓瘤细胞中得到表达。源基因在鼠骨髓瘤细胞中得到表达。鼠骨髓瘤细胞的特点：鼠骨髓瘤细胞的特点： 细胞易于培养和转染，可在无血清培细胞易