分泌人源性单克隆抗体永生化淋巴细胞系的构建

1、    分泌人源性单克隆抗体永生化淋巴细胞系的构建*        摘要目的：构建分泌人源性单克隆抗体(McAb)的永生化B淋巴细胞系。方法：用正丁醇法提取的人卵巢癌细胞系ao10/17抗原在含免疫活化剂的无血清培基中免疫人淋巴细胞；将制备ao 10/17细胞DNA转染经体外免疫的淋巴细胞。采用ELISA筛选和有限稀释法克隆化。结果：建成4株分泌抗卵巢癌McAb的转染体细胞AT1、AT2、AT3和AT4；McAb相加试验表明，它们识别卵巢癌抗原分子的同一表位。AT4已在体外培

2、养460多天，冻存复苏后仍保持抗体产生能力。夹心ELISA发现，人源性McAb AT4能与卵巢癌细胞表面可溶性抗原发生免疫反应。结论：体外免疫和DNA转染的结合，可建成分泌人源性McAb的永生化B淋巴细胞系，为人源性McAb的产生提供了一条技术途径。主题词淋巴细胞；抗体，单克隆；转染；免疫法；卵巢肿瘤 The construction of immortalized lymphoid cell lines secreting human monoclonal antibodiesWU Su-Yun, WEN Gan-Sheng, XU Fang-Yun, LIU Qiu-Ru, GONG We

3、n-Hua, Yu Ying, YI Wei-Min, LIU Si-SunDepartment of Pathophysiology and Tumor Immunology Research, Jiangxi Medical College, Nanchang(330006)Department of Obstetrics and Gynecology First Affiliated Hospital, Jiangxi Medical College Abstract AIM:To construct immortalized lymphoid cell lines secreting

4、human monoclonal antibodies. METHODS：Human lymphocytes were immunized in serum-free media containing immunoactive reagents using ovarian cancer cell line ao10/17 antigen extracted by 1-butanol. In vitro immunized lymphocytes were transfected with DNA preparations from ao 10/17. RESULTS：Four transfec

5、tant cell lines designated AT1, AT2, AT3 and AT4 secreting monoclonal antibodies against ovarian cancer were established by ELISA-based screening and limiting dilution. All of monoclonal antibodies were reactive with the identical epitopes of ovarian cancer-associated antigen molecule in the additio

6、n test. The transfectant cell line AT4 has grown continuously in vitro culture for more than 460 days and maintained the ability of secreting antibody after frozen and recovered. Human monoclonal antibody AT4 had immunoreactions with a soluble antigen from the cell surface of ovarian cancer by using

7、 sandwich ELISA.CONCLUSION：A combination of in vitro immunization and transfection with DNA induced the construction of B-cell-derived cell lines which secrete human monoclonal antibodies, and provide a technological approach for producing human monoclonal antibody.MeSHLymphocytes; Antibodies, monoc

8、lonal;Transfection; Immunization; Ovarian neoplasms人源性单克隆抗体(human monoclonal antibody, HMcAb)优于鼠源性单克隆抗体(monoclonal antibody, McAb)，但HMcAb制备的困难颇多，特别是人B淋巴细胞的抗原致敏和永生化。近年来采用体外免疫以致敏人B细胞，但其所需要条件还不很了解。EBV转化虽可使致敏B细胞永生化，但因其存在诸多缺陷而甚少单独采用。新近兴起的基因工程抗体技术，人们寄予期望1。我们曾用DNA转染技术构建了两株永生化鼠淋巴细胞转染体，它们能不断产生抗宫颈癌McAb，并能在含血清

9、和无血清培基中长期生长2。本文报道，以低分子量卵巢癌细胞表面可溶性抗原体外免疫人脾细胞，用卵巢癌细胞DNA转染经体外免疫的人淋巴细胞；将所形成的转化细胞进行筛选和克隆，构建能产生抗卵巢癌HMcAb的永生化人转染体淋巴细胞系。材料与方法(一)培养液、细胞和细胞系：1.基础培养液：RPMI 1640培养液(Gibco),每升含5 mg胰岛素，5 mg转铁蛋白，10 g硒，2 L 乙醇胺，0.3 g谷氨酰胺，0.11 g丙酮酸钠，10 mg庆大霉素。2.人卵巢癌细胞系ao10/17：购自中国科学院细胞生物学研究所细胞库，生长于含10%(V/V)FCS的RPMI 1640培基中。3.人卵巢癌细胞OV：

10、来自江西省妇产医院经确诊的卵巢癌病人的腹水，离心后用PBS洗3次，备用或-70冻存。4.人脾细胞：来自一附院外科脾破裂病人手术切除的标本。切碎、通过200目不锈钢网，Tris-NH4Cl处理5 min，制成悬浮细胞，备用或-70冻存。(二)人卵巢癌细胞表面可溶性抗原的制备：按本室报道的LeGrue正丁醇提取法的改良法3，将ao 10/17和OV细胞分别用2.5%正丁醇处理5 min，然后离心10 min，收集上清；将上清离心(15 000×g)30 min，透析，制得人卵巢癌细胞表面可溶性抗原，ao CBE和OVCBE，将前者进行SDS-PAGE测定。(三)人淋巴细胞体外免疫：1.体

11、外免疫培基制备：将基础培基加入IL-2(2.5×104 U/L)和IFN-(4×105U/L)。2.体外抗原刺激：将制得的人脾细胞(3×109/L)悬浮于体外免疫培基中；加入ao CBE(6 mg/L)，24 h后加入FCS(终浓度为15%)；置于37，7% CO2孵育箱内培养15 d，其间每隔4 d加入20%体外免疫培基。获得的致敏人淋巴细胞供DNA转染用。(四)卵巢癌细胞ao 10/17 DNA转染致敏淋巴细胞：按我们发表的Jonak等的方法的改良法2并参照Sambrook等的方法4制备DNA和DNA共沉淀物并将后者转染致敏淋巴细胞。(五)淋巴细胞转染体产生的

12、特异性抗体的检测：按间接ELISA3：用包被缓冲液稀释ao CBE至5 mg/L，酶标板每孔加入50 L，4孵育过夜；加入50 L转染体细胞培养上清液(以正常人脾细胞培养上清液为阴性对照)，37孵育2 h；最后加入底物(OPD)溶液50 L，37孵育30 min。终止后，以酶标仪测定A490 值。(六)转染体细胞克隆化：96孔培养板加入BALB/C小鼠脾细胞，将针对ao CBE的特异性IgG抗体阳性反应转染体细胞，按有限稀释法做单克隆细胞培养。(七)转染体McAb的制备：将克隆3次的转染体细胞在含10%小牛血清培基中扩大培养，其培养上清液用硫酸铵沉淀。(八)HRP标记McAb AT4：按Win

13、ston等5的方法，制成HRP-AT4。质量鉴定后，分装、冻存。(九)McAb夹心ELISA的建立：按本室以前报道的方法3。(十)McAb的表位特异性分析：按Friguet等6报道的ELISA McAb相加实验测定McAb的抗原识别表位。(十一)McAb的效价测定：用间接ELISA测定转染体细胞培养上清液的效价。(十二)McAb的特异性鉴定：用间接和夹心ELISA测定McAb与ao CBE和OVCBE的免疫反应。结果(一)癌细胞DNA转染诱导体外免疫人淋巴细胞永生化：从人卵巢癌细胞系ao 10/17提取的DNA，其A260/A280比值为1.8-1.9；用其制得的DNA共沉淀物转染经ao CB

14、E(SDS-PAGE测定为低分子量抗原，24.552.3 kD)体外致敏的人淋巴细胞。1. DNA转染淋巴细胞的形态学：转染后第8 d，在倒置相关显微镜下可见转化细胞灶，转化细胞体积较淋巴细胞大，略显大小不一，密度较未转化细胞高，但仍保持典型的淋巴样细胞形态。第2周可见簇状的转化细胞集落，其细胞数量迅速增加。第8周可见多种形态的淋巴样细胞集落(1)。8个月后，细胞紧密贴壁，其间有明显基质(2)。Fig 1 Inverted phase-contrast photomicrograph of immortalized human lymphoid cell line established by

15、 in vitro immunization and DNA transfection. Eight weeks after transfection (magnification ×33) 1体外免疫和DNA转染建立的永生化人淋巴细胞系(转染后8周)Fig 2 Inverted phase-contrast photomicrograph of immortalized human lymphoid cell line established by in vitro immunization and DNA transfection. Eight months after tran

16、sfection (magnification ×132) 2体外免疫和DNA转染过后的永生化人淋巴细胞系(转染后8个月)2.DNA转染体淋巴细胞的筛选、克隆化和永生化：在转染后第2周出现转化细胞时，用间接ELISA检测DNA转染体淋巴细胞培养上清液与卵巢癌抗原ao CBE的免疫反应。将IgG抗体阳性反应转染体细胞按有限稀释法进行3次克隆化，获得4株DNA转染体淋巴细胞系，命名为AT1、AT2、AT3和AT4。经ELISA McAb相加试验证明，它们均针对卵巢癌细胞表面可溶性抗原分子同一表位。选择其中1株AT4转染体细胞系进行研究；迄今，AT4已经过460多天连续培养，McAb的分泌

17、持续稳定，冻存复苏后依然如此。上述结果说明，体外免疫和DNA转染人淋巴细胞，可使其永生化，并产生McAb。二、卵巢癌转染体McAb的特性：1.McAb的效价：将转染体细胞系AT4的培养上清液用PBS进行倍比系列稀释后，用间接ELISA测定，测得其效价为164。2.McAb的特性：在间接和夹心ELISA中，McAb AT4能与人卵巢癌细胞表面可溶性抗原ao CBE和卵巢癌病人腹水中癌细胞表面可溶性抗原OVCBE发生免疫反应(表1)。说明人源性 McAb AT4能识别卵巢癌相关抗原。表1ELISA测定McAb AT4与卵巢癌细胞CBE和正常人血清的反应Tab 1 Reactivity of McA

18、b AT4 with CBE of ovarian cancer cellsand normal serum in ELISASample obsorbanceRatio of sample absorbanceat 490to control absorbanceao CBE0.532.7OVCBE0.9254.87NS0.19ao=ovarian cancer cell line ao10/17; OV=ovarian cancer cells of ascites from a patient with ovarian cancer;CBE=crude butanol extract;

19、NS=serum of normal females讨论(一)DNA转染诱导B细胞永生化：人源性McAb虽难以采用杂交瘤技术制得，但可用DNA转染、EBV感染、人淋巴细胞在SCID小鼠中构建以及基因工程技术特别近年发展的抗体组合文库技术以制备适于临床应用的HMcAb;这些技术各有特点，可相互取长补短。本研究采用DNA转染经ao CBE体外免疫的人淋巴细胞，构建4株永生化转染体细胞系，它们能不断分泌针对人卵巢癌细胞表面可溶性抗原的McAb，说明DNA转染技术可构建永生化抗体产生淋巴细胞系。(二)体外免疫构建McAb产生细胞：Kawahara等7研究了人淋巴细胞体外致敏所需的免疫活化剂，认为胞壁肽

20、，白介素类是必需的；用此法获得的McAb, IgG比IgM多1倍以上，抗体产生效率比体内自发免疫大10倍。Niedbata等8应用EBV感染技术制备人源性McAb时，以含IL-2(2.5×104U/L)和低剂量IFN-的培基进行体外致敏。本研究采用体外免疫人淋巴细胞时，在无血清培基中只加了很低剂量的IL-2和IFN-，建成的4株淋巴细胞转染体均分泌IgG McAb。(三)体外致敏抗原：目前制得的HMcAb通常是识别胞质抗原而不是细胞表面抗原。本研究用正丁醇法3制得的低分子量ao CBE经体外免疫人淋巴细胞，建成了转染体淋巴细胞系，其所分泌的McAb能与卵巢癌细胞表面抗原和可溶性抗原以

21、及卵巢癌组织，发生免疫反应9，10，并能通过CDC和ADCC杀仿靶肿瘤细胞(另文发表)。本研究结果表明，卵巢癌细胞表面可溶性抗原体外免疫和DNA转染人淋巴细胞，可建成分泌HMcAb的永生化B淋巴细胞系。因此，体外免疫技术和分子生物学永生化的结合有希望成为产生HMcAb的一条技术途径。* 国家自然科学基金(39460031)和江西省自然科学基金(94516)资助作者单位：邬淑云温淦升徐方云刘秋如龚文华余鹰江西医学院病理生理教研室、肿瘤免疫研究室(南昌330006)妇产科易为民刘丝荪江西医学院第一附属医院参考文献1Glassy MC. Production methodes for generat

22、ing human monoclonal antibodies. Hum Antibody Hybridomas, 1993, 4:154.2Wu SY, Wen G S. DNA-transfectant cell lines producing monoclonal antibodies. Chin J Pathophysiol, 1995, 11:114.3Wu SY, Wen GS. Studies on monoclonal antibody AU14-1 and immunology of uterine cervical cancer. Chin J Pathophysiol,

23、1997, 13:437.4Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T.eds. Molecular clonong, a laboratory manual. 2nd ed. New York:Cold Spring Harbor Laboratory Prees, 1989. 1638.5Winston S E, Fuller S A, Evelegh M J, et al. Conjugation of enzymes to antibodies. In:Ausuble FM, Brent R, Kingston RE, et al.eds. Short protocols in molecular biology.3rd ed. Vo