塞来昔布对人淋巴瘤细胞株Raji增殖、凋亡及存活素表达的影响

1、塞来昔布对人淋巴瘤细胞株Raji增殖、凋亡及存活素表达的影响         11-01-12 15:06:00     编辑：studa20                   作者：范红 程远东 孙哲 吕晓东【摘要】  目的 观察选择性COX2抑制剂塞米昔布(Celecoxib)对Ra

2、ji细胞增殖、凋亡及细胞周期分布的影响，并检测存活素(Survivin)在细胞中的表达情况。方法 应用流式细胞术(FCM)分析Celecoxib对人Burkitt淋巴瘤Raji细胞周期的影响并检测细胞凋亡及存活素在细胞中的表达情况，应用RTPCR法检测细胞中Survivin mRNA的表达水平。结果 Celecoxib各浓度组作用于Raji细胞24、48、72 h后吸光度值与对照组相比均有显著性差异(P<0.05)，同时各浓度组之间以及时间组之间有显著性差异(P<0.05)。Celecoxib各浓度组作用于Raji细胞48 h后各浓度组间Celecoxib对细胞凋亡率和细胞周期的影

3、响、下调Survivin蛋白表达下调Survivin mRNA相对表达量具有显著性差异(P<0.05)。结论 Celecoxib能够通过诱导凋亡抑制Raji细胞的增殖，其机制可能与抑制Survivin表达有关。 【关键词】  Celecoxib;淋巴瘤;细胞周期;凋亡;Survivin选择性COX2抑制剂塞来昔布(Celecoxib)是近年来用于临床的新型非甾体类抗炎药，其药理作用特点是选择性作用于COX2，能使许多肿瘤细胞的增殖受到抑制，但具体机制仍未完全清楚。Survivin作为一种多肿瘤抑制基因在肿瘤细胞的凋亡过程中起调控作用。目前国内外有关Survivin表达与Cele

4、coxib诱导淋巴瘤细胞凋亡之间关系的研究尚处于空白。本实验通过体外培养人Burkitts淋巴瘤Raji细胞，观察选择性COX2抑制剂Celecoxib对Raji细胞生长增殖、凋亡及细胞周期分布的影响，并检测凋亡抑制因子Survivin在细胞中的表达情况。1 材料与方法1.1 材料 Burkitts淋巴瘤细胞株Raji由郑州大学基础医学院提供，常规培养于含10%的灭活胎牛血清(FBS)的RPMI1640培养基中，置于37，5% CO2饱和湿度培养箱内培养，23 d传代1次。台盼蓝排斥实验检测细胞拒染率均在95%以上。实验分为对照组:细胞培养基中加入与实验组等体积的DMSO。(预实验显示终浓度0

5、.1%的DMSO在实验中对Raji细胞生长没有明显影响);实验组:细胞培养基中加入DMSO溶解的Celecoxib(南京德宝生化器材有限公司)，终浓度分别为12.5、50、100、150 mol/L1。1.2 MTT法检测Celecoxib对Raji细胞生长的抑制作用 取对数生长期的Raji细胞，调节细胞浓度为1×105/ml,接种于24孔细胞培养板中，每孔100 l(1×104个细胞/孔)，分别加入处理因素，同时设对照组，每组均设3个复孔。实验重复3次。细胞孵育24、48、72 h,孵育结束前4 h，各培养孔加入MTT(Merke公司)(5 mg/ml)10 l,1 50

6、0 r/min离心10 min,弃上清，每孔加入DMSO 100 l。 震荡15 min溶解结晶，全自动酶标仪测出每孔吸光度值(A492值)，计算细胞抑制率。1.3 流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡率和周期分布 取对数生长期的Raji细胞，调节细胞浓度为1×106/ml,接种于24孔细胞培养板中，每孔1 ml(1×106个细胞吼)，分别加入处理因素，同时设对照组，每组均设3个复孔。实验重复3次。细胞孵育48 h后离心收集细胞，并用70%乙醇固定，4过夜后再经PBS洗2次，加入碘化丙啶(PI)1 ml,4避光30 min，用Beckman Coulter公司提供的流式细胞仪标

7、准程序进行分析。1.4 FCM检测Raji细胞中Survivin蛋白表达 收集细胞，去除样品中的70%乙醇，用PBS离心洗涤2次，加入Survivin鼠抗人单克隆抗体一抗(Santa公司)工作液100 l,工作浓度1100(克隆系FL142)。室温孵育30 min，PBS10 ml洗涤1次，弃上清。加入羊抗鼠FITCIgG二抗工作液100 l,室温孵育30 min，PBS 10 ml离心同上，弃上清，加入PBS 0.1 ml经500目铜网过滤后上流式细胞仪检测。1.5 RTPCR法检测Raji细胞中Survivin基因表达水平1.5.1 细胞总RNA提取:Trizol试剂盒提取RNA。1.5.

8、2 RTPCR (1)引物设计:Survivin、actin引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。Survivin:上游引物5GCATGGGTGCCCCGACGTG3，下游引物5GCTCCGGCCAGAGGCCTCAA3，扩增片段长度为447 bp;actin:上游引物5GGCGGCACCACCATGTACCC3，下游引物5AGGGGCCGGACTCGTCATAC3，扩增片段长度为202 bp。 (2)总反应体积30 l:含无菌双蒸水19.3 l，MgCl22 l,20× buffer 1.5 l，上游、下游引物各1 l,RNA模板2 l,dNTP 1.2 l,RTPCR酶混合

9、物2 l。预变性94，2 min;变性94，1 min。退火55，50 s。延伸72，50 s，共35个循环，72再延伸10 min，凝胶成像，GelPro Analyzer 3.1软件进行半定量分析。1.6 统计学分析 采用SPSS11.5统计软件进行统计学分析，所有数据采用x±s表示，各组均数的比较行单因素方差分析。2 结 果2.1 Celecoxib对Raji细胞生长的抑制作用 Celecoxib各浓度组作用于Raji细胞24、48、72 h后，对细胞生长均有抑制作用，吸光度与相应对照组相比均有显著性差异(P<0.05)，各浓度组之间以及时间组之间有显著性差异(P<

10、0.05)，说明不同浓度Celecoxib均有抑制Raji细胞增殖作用，此作用呈时间、剂量依赖性。Celecoxib各浓度组作用Raji细胞48 h后出现明显的凋亡峰，各浓度组间Celecoxib对细胞凋亡率的影响差异明显(P<0.05),说明随着Celecoxib浓度增加，可引起Raji细胞凋亡率逐渐增大，即凋亡的细胞数量与Celecoxib呈量效关系，见表1。表1 Celecoxib对Raji细胞生长的抑制作用2.2 Celecoxib对Raji细胞周期分布的影响 各浓度组Celecoxib作用Raji细胞48 h后，随药物浓度增加，G0/G1期细胞比例逐渐增加，S期及G2/M期细胞

11、比例逐渐减少。Celecoxib可阻滞Raji细胞于GO/G1期，且随着Celecoxib浓度的增加，阻滞作用增强，呈一定剂量依赖关系(P<0.05)，见表2。表2 Celecoxib对Raji细胞周期分布的影响2.3 Celecoxib对Raji细胞Survivin蛋白和Survivin mRNA表达水平的影响 Celecoxib各浓度组作用Raji细胞48 h后，随着Celecoxib浓度的增加，Raji细胞中Survivin蛋白的表达率逐渐减低，呈一定剂量依赖关系。Celecoxib不同浓度组间下调Survivin蛋白表达也具有显著意义(P<0.05)(表3)。Raji细胞中Survivin mRNA 的相对表达量逐渐减低，呈一定剂量依赖关系。Celecoxib不同浓度组间下调Survivin mRNA表达具有统计学意义(P<0.05)，见图1。1：Celecoxib 150 mol/L，2：Celecoxib 100