番荔枝内酯对人淋巴瘤Raji细胞体外增殖和凋亡的影响

1、番荔枝内酯对人淋巴瘤Raji细胞体外增殖和凋亡的影响         11-05-03 14:38:00     作者：刘昌发,赵永新    编辑：studa20【摘要】  目的 研究番荔枝内酯对体外人淋巴瘤Raji细胞体外增殖和凋亡的影响及其可能机制。方法 将体外培养的Raji细胞分为番荔枝内酯组、阿霉素对照组及未干预组,番荔枝内酯药物浓度按6.25、12.5、25、50 g/mL分级作用于细胞。采用四甲基偶氮唑蓝比色法检测

2、细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡率,免疫组化染色检测各组细胞半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9(caspase-9)的表达情况。结果 番荔枝内酯组细胞增殖率均低于未干预组,25、50 g/mL药物浓度组细胞增殖率低于阿霉素组,增殖率与浓度及培育时间负相关；番荔枝内酯组细胞凋亡率高于未干预组,25、50 g/mL药物浓度组凋亡率高于阿霉素组,和浓度、时间正相关；与未干预组相比,番荔枝内酯组caspase-9表达量逐步增加,与阿霉素组比较,6.25 g/mL组caspase-9表达低于阿霉素组(P0.05),50 g/mL浓度组表达高于阿霉素组(P0.05)。结论 番荔枝内酯对体外人淋巴瘤Raji细胞的增

3、殖有抑制作用,并可能通过线粒体途径促进其凋亡。 【关键词】  番荔枝内酯；抗肿瘤；凋亡；增殖；caspase-9；Raji细胞    Abstract：Objective To investigate the effects of annonaceous acetogenin on proliferation and apoptosis in Raji cells and its mechanism. Methods Raji cells cultured in vitro were divided into control group, annonac

4、eous acetogenin group and adriamycin group. Raji cells were effected by 6.25, 12.5, 25, 50 g/mL annonaceous acetogenin. Proliferation of Raji cells were evaluated by MTT assays, apoptosis percentage was assessed by flow cytometry. Caspase-9 protein was detected by immunohistochemistry. Results The R

5、aji cell proliferation rate of annonaceous acetogenin decreased compared with the control, that of 25, 50 g/mL group were lower than adriamycin group, and it was related to the concentration, relying on the incubating time. The apoptosis rate was higher than control, that of 25, 50 g/mL group were h

6、igher than adriamycin group, and it was related to the concentration and the incubating time. The expression of caspase-9 protein of annonaceous acetogenin group was higher than control, and it had a positively relationship with the concentration and incubating time. Conclusions Annonaceous acetogen

7、in could inhibit cell proliferation in a dose-dependent and time-dependent manner in Raji cells, and it may induce Raji cells apoptosis by up-regulating caspase-9 expression.    Key words：annonaceous acetogenin；antitumor；apoptosis；proliferation；caspase-9；Raji cell   

8、60; 番荔枝(Annona squamosa Linn.)为番荔枝科番荔枝属植物,我国广东、广西、海南、福建、云南等省及台湾地区均有栽培,东南亚、南美国家及地区也有广泛分布。番荔枝内酯(annonaceous acetogenins)分布在番荔枝科多种植物的根、树皮、种子、叶以及果实中。研究表明番荔枝内酯是一类很有希望的新抗癌药物。笔者研究番荔枝内酯在淋巴瘤治疗中的应用,现将体外实验结果报道如下。1  实验材料1.1  药物    番荔枝内酯类化合物：为本研究组参照Dos Santos等1方法从番荔枝种子中提取分离所得,为白色蜡状粉末。使用前

9、以少许无水乙醇溶解,加生理盐水配制成所需浓度,乙醇终浓度不超过1%；盐酸阿霉素为意大利法玛西亚公司产品。1.2  主要试剂    四甲基偶氮唑蓝(MTT,美国Sigma公司),AnnexinV-FITC凋亡检测试剂盒(南京凯基生物公司),半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9 (caspase-9)免疫组化试剂盒(深圳晶美生物工程有限公司)。1.3  瘤株    人Burkitts淋巴瘤细胞系Raji细胞购自华中科技大学同济医学院免疫教研室,并由本院实验室传代保存。2  实验方法2.1  分组 &

10、#160;  番荔枝内酯组：细胞培养基中加入生理盐水溶解的番荔枝内酯,实验终浓度分别为6.25、12.5、25、50 g/mL；未干预组：细胞培养基中加入与实验组等体积的生理盐水；阿霉素组：细胞培养基中加入生理盐水溶解的阿霉素,终浓度为0.1 g/mL。2.2  MTT比色试验    取处于对数生长期的Raji细胞1×105/mL,接种于96孔培养板,分别加入不同浓度番荔枝内酯以及阿霉素各10 L,孵育24、48、72 h。孵育结束前4 h,各培养孔加入MTT(5 mg/mL)10 L,离心,弃上清,加入10%二甲基亚砜震荡溶解结晶,

11、上酶标仪于波长492 nm处测吸光度(OD)值。通过OD值计算细胞增殖抑制率。流式细胞仪测定细胞凋亡率。细胞增殖抑制率(%)(未干预组OD均值实验组OD均值)/未干预组OD均值×100%。2.3  实验步骤    严格按照AnnexinV-FITC凋亡检测试剂盒说明进行。每份样品检测105个细胞,双参数结果以二维散点图显示,数据由FCM的计算机软件分析输出。2.4  免疫细胞化学法检测caspase-9蛋白表达    将处理组和对照组细胞用PBS洗1遍,调整细胞浓度1×105/mL,取50 L滴

12、片,无水丙酮固定20 min,晾干。严格按照试剂盒操作步骤进行,滴加正常山羊血清,一抗caspase-9兔抗人多克隆抗体,二抗山羊抗兔IgG孵育,滴加辣根酶标记工作液,DAB显色,苏木素轻度复染,中性树脂封片。以PBS代替一抗作染色的阴性对照。结果判定：细胞胞浆出现棕黄色颗粒为阳性细胞,在高倍光镜下至少观察200个细胞,计算阳性细胞数。3  统计学方法    数据为计量资料。统计分析采用SPSS13.0软件。实验数据以x±s表示,多组间比较用方差分析,2组间比较用t检验；以P0.05认为差异有统计学意义。4  结果4.1  番荔枝内酯对细胞caspase-9蛋白表达的影响    在番荔枝内酯组中,随着药物浓度的增大、作用时间的延长,细胞中caspase-9蛋白表达量逐步增加,与未干预组比较,各组表达量均高于未干