高速逆流色谱技术及应用领域ppt课件

1、高速逆流色谱技术及应用领域高速逆流色谱技术及应用领域上海同上海同田生物技术有限公司田生物技术有限公司报告内容报告内容 1 1 高速逆流色谱原理高速逆流色谱原理2 2 高速逆流色谱优点高速逆流色谱优点3 3 高速逆流色谱应用高速逆流色谱应用4 4 关于上海同田生物关于上海同田生物1.1.高速逆流色谱原理高速逆流色谱原理 液液分配色谱利用一种特殊的流体动力学现象使互不混溶的两相溶剂(固定相和流动相)在螺旋管中高效地接触、混合、分配和传递其中固定相以一种相对均匀的方式分布在一根聚四氟乙烯管绕成的螺旋管中流动相以一定的速度通过固定相，并按照被分离物质分配系数的不同依次洗脱而获得分离特殊的流体动力学？特

2、殊的流体动力学？固定相的保留固定相的保留利用螺旋管的方向性和同步行星式运动利用螺旋管的方向性和同步行星式运动产生的二维产生的二维 离心力场形成的单向性流体动力学平离心力场形成的单向性流体动力学平衡衡HDESHDES）从而实现流动相高速移动时固定相的保从而实现流动相高速移动时固定相的保留留混合区：在靠近离心混合区：在靠近离心轴心大约有四分之一轴心大约有四分之一的区域，两相的激烈的区域，两相的激烈混合混合静置区：两相溶剂分静置区：两相溶剂分成两层，重相在外部，成两层，重相在外部，轻相在内部轻相在内部 以以10001000转转/ /分的速率进行旋分的速率进行旋转，在二维力场的作用下转，在二维力场的作

3、用下分离管柱内混合和传递的分离管柱内混合和传递的频率可达到频率可达到1717次次/S/S，从而，从而实现高效的分离实现高效的分离K Cs/Cm CsCmHSCCC的工作流程的工作流程2.2.高速逆流色谱优点高速逆流色谱优点 不用固态载体的高效液不用固态载体的高效液- -液分配色谱技术液分配色谱技术不存在样品的不可逆吸附，理论回收率不存在样品的不可逆吸附，理论回收率100%100%样品负载能力强，制备量大，重现性好样品负载能力强，制备量大，重现性好操作成本低，无制备柱消耗，后续投入较低操作成本低，无制备柱消耗，后续投入较低可采用广泛的溶剂体系和多样性的操作条件可采用广泛的溶剂体系和多样性的操作条

4、件操作简单，无需太多样品前处理操作简单，无需太多样品前处理 3.3.高速逆流色谱应用高速逆流色谱应用 高速逆流色谱技术的应用领域高速逆流色谱技术的应用领域1 高速逆流色谱在中药现代化中的应用高速逆流色谱在中药现代化中的应用2 高速逆流色谱在抗生素分离纯化中的应用高速逆流色谱在抗生素分离纯化中的应用3 高速逆流色谱在异构体分离纯化中的应用高速逆流色谱在异构体分离纯化中的应用4 高速逆流色谱在食品行业中的应用高速逆流色谱在食品行业中的应用5 高速逆流色谱在化学合成中的应用高速逆流色谱在化学合成中的应用6 高速逆流色谱在生物领域中的应用高速逆流色谱在生物领域中的应用7 高速逆流色谱在发酵产物分离纯化

5、中的应用高速逆流色谱在发酵产物分离纯化中的应用成药质量控制成药质量控制 指纹图谱指纹图谱指导原药材种植指导原药材种植/GAP基地建设基地建设单体化合物单体化合物用于制药中间体的质用于制药中间体的质量控制量控制实例实例1 1 大黄有效成分的分离大黄有效成分的分离01002003004005002004006008001000 VIVIVIIIIIIAbsorbance(mV)Time/min0102030400100200300400500600 physcionchrysophanolemodinrheinaloe-emodincinnamic acidAbsorbance(mAU)Time/

6、minHSCCC条件：条件：固定相：乙醚固定相：乙醚流动相：流动相：1%NaH2PO4-1%NaOH 梯度梯度洗脱洗脱(500min内内,由由100:0-0:100) 流速流速: 2.0 ml min-1转速：转速：800 rpm样品量：样品量：120 mg 粗提物粗提物固定相保留：固定相保留：40%机型：机型：TBE-300A：rhein大黄酸大黄酸19 mg: cinnamic acid苯乙烯酸苯乙烯酸19 mg: emodin大黄素大黄素18 mg: aloe-emodin芦荟大黄素芦荟大黄素14 mg: chrysophanol （大黄酚（大黄酚10 mg: physcion大黄素甲醚

7、大黄素甲醚6 mg纯度均在纯度均在98以上以上Journal of Chromatography A,2019,Volume 1052, Issues 1-2, Pages 217-221HSCCCHSCCC在分离中药单体中的应用蒽醌类）在分离中药单体中的应用蒽醌类）实例实例2 2 蛇床子有效成分的分离蛇床子有效成分的分离HSCCC条件：条件：溶剂系统溶剂系统: 石油醚石油醚-乙酸乙酯乙酸乙酯-甲醇甲醇-水水流动相：梯度洗脱流动相：梯度洗脱0-150 min:5:5:5:5下相下相150-250 min:5:5:6:4下相下相250 min后后: 5:5:6.5:3.5下相下相流速流速: 2.

8、0 ml min-1转速：转速：800 rpm样品量：样品量：150 mg 粗提物粗提物机型：机型：TBE-300A固定相保留：固定相保留： 60%：花椒毒素：花椒毒素 95.0 7.6 mg: 异茴芹素异茴芹素 99.6 7.6 mg: 佛手苷内酯佛手苷内酯 99.7 9.7 mg: 欧前胡素欧前胡素 100 60.5 mg: 蛇床子素蛇床子素 100 50.6 mg:未知化合物未知化合物 98.1 10.2 mg051015202530350200400600800UnknownOstholeImperatorinBergaptenIsopimpinellinXanthotoxin Aso

9、rbance (mAU)Time (min)01002003004005002004006008001000VIVIVIIIIII Absorbance (mV)Time (min)Journal of Chromatography A, 2019, Volume 1055, Issues 1-2, 71-76 HSCCCHSCCC在分离中药单体中的应用香豆素类）在分离中药单体中的应用香豆素类）Journal of Chromatography A,1102(2019)44-50实例实例3 3 白花败酱异戊烯基黄酮的分离白花败酱异戊烯基黄酮的分离溶剂系统溶剂系统:正己烷正己烷-乙酸乙酯甲醇乙酸

10、乙酯甲醇-水水 (5:6:6:6)流动相：下相流动相：下相流速流速: 1.0-2.0 ml min-1转速：转速：850 rpm样品量：样品量：400 mg 粗提物粗提物固定相保留：固定相保留： 65%分离温度分离温度: 25C机型：机型：TBE-300A: orotinin （牡荆苷（牡荆苷99.2 38.2 mg: orotinin-5-methyl ether 98.5 19.8 mg: licoagroachalcone B 97.6 21.5 mgHSCCCHSCCC在分离中药单体中的应用在分离中药单体中的应用( (黄酮类黄酮类) )实例实例4 4 吴茱萸生物碱的分离吴茱萸生物碱的分

11、离溶剂系统溶剂系统:正己烷正己烷-乙酸乙酯乙酸乙酯-甲醇甲醇-水水 (5:5:7:5)流速流速: 2.0 ml/min转速：转速：900 rpm样品量：样品量：180 mg 粗提物粗提物固定相保留：固定相保留：50%机型：机型：TBE-300A:吴茱萸碱吴茱萸碱 98.7 28 mg:吴茱萸次碱吴茱萸次碱 98.4 19 mg:吴茱萸新碱吴茱萸新碱 96.9 21 mg: 1-methy-2-(6Z,9Z)-6,9-pentadecadienyl-4-(1H)-quinolone. 98.0 16 mg: 1-methyl-2-dodecyl-4-(1H)-quinolone 97.2 12

12、mg01020304050600200400600800A1-Methyl-2-dodecyl-4-(1H)-quinolone1-Methy-2-(6Z,9Z)-6,9-pentadecadienyl -4-(1H)-quinoloneEvocarpineRutaecarpineEvodiamine Absorbance (mAU) / 254 nmTime (min)01002003004005006002004006008001000VIVIIIIII Absorbance (mV) / 254 nmTime (min) J. Chromatogr. A, 2019, vol 1074/

13、1-2 pp. -144HSCCCHSCCC在分离中药单体中的应用生物碱类）在分离中药单体中的应用生物碱类）芦荟苷芦荟苷B B芦荟苷芦荟苷A A芦荟未知物芦荟未知物芦荟提取物芦荟提取物HSCCC分离图谱分离图谱丹参提取物的丹参提取物的HSCCC分离图谱分离图谱丹酚酸丹酚酸 B B沙棘提取物的沙棘提取物的HSCCC图谱图谱异鼠李素异鼠李素山奈酚山奈酚槲皮素槲皮素-10.00033.60077.200120.800164.400208.0000.0024.0048.0072.0096.00120.00144.00 168.00192.00 216.00240.00mvmin高车前素高车前素未知物未

14、知物泽兰黄酮泽兰黄酮荔枝草提取物的荔枝草提取物的HSCCC图谱图谱小结：小结： HSCCC在中药中各类单体的制备均有应在中药中各类单体的制备均有应用，经用，经过简单的前处理提取、萃取或大孔树脂过简单的前处理提取、萃取或大孔树脂柱后柱后直接上样，一次分离就能得到高纯度和高直接上样，一次分离就能得到高纯度和高得率的得率的单体，已成为天然产物分离纯化中有效的单体，已成为天然产物分离纯化中有效的不可替不可替代的分离方法。代的分离方法。HSCCCHSCCC在中药指纹图谱中的应用在中药指纹图谱中的应用 中药指纹图系指中药经适当处理后，采用一定的分析手段光中药指纹图系指中药经适当处理后，采用一定的分析手段光

15、谱和色谱得到的能够标示该中药特性的共有峰的图谱谱和色谱得到的能够标示该中药特性的共有峰的图谱 中药成分复杂，指纹图谱是中药质量控制的有效方法中药成分复杂，指纹图谱是中药质量控制的有效方法 20002000年年8 8月国家药品监督管理局规定中药注射剂必须建立药材月国家药品监督管理局规定中药注射剂必须建立药材和制剂的指纹图谱标准，美国和制剂的指纹图谱标准，美国FDAFDA及欧共体药审委也要求采用及欧共体药审委也要求采用指纹图谱技术指纹图谱技术 色谱法是指纹图谱的首选，传统的色谱指纹图谱方法存在缺陷色谱法是指纹图谱的首选，传统的色谱指纹图谱方法存在缺陷比如比如HPLCHPLC法前处理要求严格，会有死

16、吸附或样品的变性，对法前处理要求严格，会有死吸附或样品的变性，对有些样品不能准确反应其特征）有些样品不能准确反应其特征） 高速逆流色谱法是中药指纹图谱发展的一个新方向高速逆流色谱法是中药指纹图谱发展的一个新方向02040608010012014001234567891011121314Time (h)Absorbance (OD280nm)0102030400100200mAU (280nm)Time (min) 01020304004080120160mAU (280nm)Time (min) 0102030400100200mAU (280nm)Time (min) B1B2B305010

17、015020025001234567891011121314Time (h)Absorbance (OD280nm)02040608010001234567891011121314Time (h)Absorbance (OD280nm)A1A2A3HSCCCHSCCC图谱图谱 HPLC HPLC图谱图谱不同产地丹参提取物不同产地丹参提取物实例实例溶剂体系：石油醚溶剂体系：石油醚-丙酮丙酮-水水（3:3:2,v/v）样品：样品：250mg 环孢菌素粗品环孢菌素粗品检测条件：检测条件：ELSD环孢菌素环孢菌素 A98.6%，90.2%(收率收率)环孢菌素环孢菌素 C99.3，85.0%(收率收率)

18、环孢菌素环孢菌素 B98.7，88.5%(收率收率)环孢菌素环孢菌素 D98.5，86.3%(收率收率)实例实例1 1 环孢菌素粗品环孢菌素粗品 HSCCC在抗生素分离纯化中的应用在抗生素分离纯化中的应用溶剂体系：正己烷溶剂体系：正己烷-乙酸乙酯乙酸乙酯-甲醇甲醇-0.5氨水氨水3:7:5:6,V/V），），检测器：检测器：ELSD；进样量：；进样量：300mg红霉素红霉素A和和C含量均在含量均在98以上以上实例实例2 2 红霉素红霉素HSCCC在抗生素分离纯化中的应用在抗生素分离纯化中的应用 实例实例1 1 藤黄酸异构体的分离藤黄酸异构体的分离溶剂系统溶剂系统:正己烷正己烷-甲醇甲醇-水水

19、(5:4:1)流动相：下相流动相：下相流速流速: 2.0 ml min-1转速：转速：900 rpm样品量：样品量：50 mg固定相保留：固定相保留： 50%分离温度分离温度: 25CA. gambolic acid 97.2% B. epigambolic acid 97.5%闭合回路系统闭合回路系统Journal of Chromatography A, 2019, Volume 1127, 298-301 HSCCCHSCCC在异构体分离纯化中的应用在异构体分离纯化中的应用实例实例1 1 利用利用HSCCCHSCCC分离标准蛋白质混合物分离标准蛋白质混合物010020030002468S

20、ignal (mV)Time (min)123溶剂体系：溶剂体系：PEG1000-PEG1000-磷酸盐体系磷酸盐体系- -水水14-16-70(%,w/w)14-16-70(%,w/w)样品：样品：1mg 1mg 细胞色素细胞色素C C、 20mg 20mg 溶菌酶、溶菌酶、5mg 5mg 血红蛋白血红蛋白1.Cytochrome C; 1.Cytochrome C; 2.Lysozyme ; 2.Lysozyme ; 3.Hemoglobin 3.Hemoglobin ( (反转出峰，上相反转出峰，上相为流动相为流动相) )色谱，色谱，2019,Vol.23 No.1 122019,Vol

21、.23 No.1 121717HSCCC在蛋白质分离纯化中的应用在蛋白质分离纯化中的应用溶剂体系：溶剂体系：PEG1000-PEG1000-磷酸二氢钾磷酸二氢钾- -水水15-17-68(%,w/w)15-17-68(%,w/w)样品：样品：1mg 1mg 细胞色素细胞色素C C、8mg 8mg 肌红蛋白、肌红蛋白、20mg20mg溶菌酶溶菌酶1.Cytochrome C;2.Myoglobin 3.Lysozyme实例实例2 2 利用利用HSCCCHSCCC分离标准蛋白质混合物分离标准蛋白质混合物HSCCC在蛋白质分离纯化中的应用在蛋白质分离纯化中的应用 从上面这些实例可以看出，从上面这些实

22、例可以看出，HSCCCHSCCC作为作为一种高效的液液分配色谱，拥有广阔的一种高效的液液分配色谱，拥有广阔的应用空间。应用空间。4.4.关于上海同田生物技术有限公司关于上海同田生物技术有限公司 公司位于上海张江科技园，占地约公司位于上海张江科技园，占地约3030亩，建筑面亩，建筑面积约积约2000020000平方米，总投资人民币平方米，总投资人民币60006000万元。万元。 2019 2019年年1111月月2525日，上海市高新技术企业认定办公日，上海市高新技术企业认定办公室公告，上海同田生物技术有限公司被认定为上海市室公告，上海同田生物技术有限公司被认定为上海市20192019年第一批高

23、新技术企业。年第一批高新技术企业。 公司致力于高速逆流色谱仪HSCCC）、高纯度天然产物有效成分单体、天然药物原料/中间体的研究开发、生产和销售。 作为多分离柱高速逆流色谱仪国家新型专利的拥有者、高速逆流色谱领域的领导者，我们与通用电气医疗生物科学中国有限公司GE Healthcare Bio-sciences co., ltd .）建立了长期的合作伙伴关系。TBE300BKTA Prime 在高速逆流色谱技术领域，公司所研制并批量生在高速逆流色谱技术领域，公司所研制并批量生产拥有自主知识产权的新型多分离柱高速逆流色谱仪，产拥有自主知识产权的新型多分离柱高速逆流色谱仪，性能稳定可靠，有分析型、半制备型、制备型等性能稳定可靠，有分析型、半制备型、制备型等7 7种种不同产品：不同产品：国内部分代表客户名单：国内部分代表客户名单：香港赛马会中药研究院香港赛马会中药研究