基于静电沉积壳聚糖铂纳米颗粒复合膜构建葡萄糖生物传感器 -

1、第23卷第6期2010年6月传感技术学报CH I N ESE JOURNAL OF SE NS ORS AND ACT UAT ORSVol .23No .6Jun .2010项目来源:甘肃省科技支撑计划资助项目(0708GKC A062收稿日期:2009-12-30修改日期:2010-01-28Electrodepositi on of Chitos an and Pl ati n u m Nanoparti cles forFabr i cati on of an Ampero metri c Glucose Bi osensor3FAN Zengjie,MA L iping,L I Yu

2、nxia,L I U Guohan,L I Gongnong,HAN Genliang3(Institute of Sensor Technology,Gansu Province A cade m y of Sciences,L anzhou 730000,China Abstract:A composite fil m via depositi on of chit osan /p latinu m nanoparticles was constructed on a g old electr ode using electriche m ical methods .Glucose bi

3、osens or was f or med with glucose oxidase i m mobilized in composite i m mo 2bilizati on me mbrane matrix,which was composed of chit osan and p latinu m nanoparticles by using glutaraldehyde as a cr oss 2linking agent .The res ponse ti m e of bi osens or is only about 8s,with a range fr om 1×1

4、0-5t o 1×10-3mol/L and a detecti on li m it of 1.4×10-5mol/L (S/N =3.0.Mean while,the bi osens or has higher sensitivity and l ongti m e stability .Key words:bi osens or;i m mobilizati on enzy me;glucose oxidase;chit osan;p latinu m nanoparticles EEACC:7230J基于静电沉积壳聚糖铂纳米颗粒复合膜构建葡萄糖生物传感器3范增杰,

5、马莉萍,李云霞,刘国汉,李工农,韩根亮3(甘肃省科学院传感技术研究所,兰州730000摘要:利用电沉积方法对壳聚糖/铂纳米颗粒复合膜进行组装,以戊二醛作为交联剂固定葡萄糖氧化酶,构建葡萄糖生物传感器。实验结果表明:制得的葡萄糖生物传感器响应时间仅为8s,线性测量范围为1×10-51×10-3mol/L,检测限为1.4×10-5mol/L (S/N =3.0。该传感器灵敏度高,稳定性好。关键词:生物传感器;固定化酶;葡萄糖氧化酶;壳聚糖;铂纳米颗粒中图分类号:TP212.2文献标识码:A 文章编号:1004-1699(201006-0764-04葡萄糖氧化酶包含一个

6、核黄素腺嘌呤二核苷,其为葡萄糖氧化酶的氧化还原中心,但其深深包埋于酶蛋白内部,使酶与固体基底电极间的电子转移比较困难1,而金属纳米材料的发现很好的解决了这一问题。主要是由于纳米材料具有较高的比表面积和较高的吸附性能,能够改善酶的活性中心和基底电极间电子传递的效率2-4,使酶电极的电流响应灵敏度得到显著提高。金属纳米颗粒逐渐取代电子媒介体成为电化学反应中优良的电子媒介。目前利用金属纳米颗粒修饰电极制备传感器检测葡萄糖的研究已有很多报道,主要有纳米金5-6、纳米银7、纳米铜8和纳米铂9-10等。对于金纳米颗粒应用于传感器的研究较多也相对比较成熟,但是对于铂纳米颗粒的研究相对较少,一些研究发现铂纳米

7、颗粒可以降低传感器的工作电位11,对过氧化氢具有一定的催化作用12。壳聚糖不易溶于水、碱溶液和稀的硫酸、磷酸,可溶于HCl 、HNO 3和HAc 等酸中13-14成膜后具有很好的吸附性、稳定性和良好的生物相容性,其丰富的氨基也使它被广泛用于生物分子的固定和修饰电极的制备15。由于壳聚糖含有很多氨基基团,其pKa 大约是6.3,当溶液的pH 低于6.3,此时壳聚糖溶液为水溶状态,当pH 高于6.3时,此时壳聚糖溶液由水溶状态变为不溶状态16。通过静电沉积壳聚糖成膜后,该膜具有良好的选择透性和较强的抗干扰能力。本文将铂纳米颗粒用于葡萄糖传感器的构造,制成了葡萄糖氧化酶/铂纳米颗粒/壳聚糖/金电极电

8、流型生物传感器,以测定葡萄糖的含量。实验发现铂纳米颗粒具有良好的催化性能。该传感器具有制作过程简单、灵敏度高、检测限低、稳定性好等特点。第6期范增杰,马莉萍等:基于静电沉积壳聚糖铂纳米颗粒复合膜构建葡萄糖生物传感器1实验部分1.1试剂与仪器葡萄糖氧化酶(G OD和壳聚糖(CS,脱乙酰度85%购自Sig ma公司;H2Pt CL66H2O,Na BH4,葡萄糖,铁氰化钾,亚铁氰化钾和氯化钾均为分析纯。实验用水为三蒸水。电化学工作站为LK22005,测试系统为三电极体系,金电极(直径3mm为工作电极,饱和甘汞电极为参比电极,铂片为辅助电极。1.2金电极清洁金电极先用麂皮打磨,再以平均粒径为0.05

9、m的氧化铝砂浆打磨成镜面,用蒸馏水冲洗干净后于80的Piranha(H2S O4-H2O2,体积比3:1溶液中浸泡3m in,除去有机物等难以除去的杂质。电极取出后用蒸馏水反复冲洗。分别放入乙醇、蒸馏水中超声洗涤,用蒸馏水冲洗干净,在0.1mol/L的H2S O4中反复中进行循环伏安扫描,扫描电位范围-0.2+1.4V,直至得到稳定的循环伏安曲线。1.30.5%壳聚糖溶液的制备将50mg壳聚糖溶于10mL1%的乙酸中,超声3h,直至完全溶解,用浓的氢氧化钠将其pH调至4.0-5.0。1.4含铂纳米颗粒壳聚糖的制备按照文献17,取配制好的壳聚糖加入1mL 0101mmol/L的H2Pt Cl66

10、H2O,超声10m in,最后加入50L新配制的5%的Na BH4溶液将高价铂还原成铂纳米颗粒,生成的铂纳米颗粒直径约30n m。1.5酶电极的制备将清洁好的金电极置于含铂纳米颗粒的壳聚糖溶液中,于恒电位-1.5V下,静电沉积120s。随着氢离子的析出,溶液的pH逐渐升高,当pH超过6.3时,含铂纳米颗粒的壳聚糖溶液由可溶状态变为不溶状态,并在金电极表面形成一层含铂纳米颗粒的壳聚糖薄膜。取出凉干,接着浸入0.25%的戊二醛交联2h,经去离子水水洗,然后置于2mg/ 100LG OX中浸泡12h,取出用P BS清洗,即可制得传感器,不用时于4的冰箱中保存。1.6测量方法采用三电极系统:以所研制的

11、金电极为工作电极,饱和甘汞电极(SCE为参比电极,铂片为对电极;以0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液(PH7.0为支持电解质,35下,加入不同浓度的葡萄糖,在0.5 -0.2V范围内进行循环扫描,记录循环伏安扫描曲线。计时电流法测定时,工作电位为0.4V(vsSCE,搅拌时测定。2结果与讨论2.1电极表征铁氰化钾的循环伏安法是表征修饰电极电子传递能力的一种方便而有效的方法。图1是不同修饰电极在5.0mMFe(CN64-/3-(0.1mol/L KCl中的循环伏安特性曲线。图中,a为裸金电极,b为壳聚糖铂纳米颗粒修饰电极,c为固定葡萄糖氧化酶后的电极。从图1可以看出b比a的峰电流明显增大,电流增大主

12、要是由于铂纳米颗粒沉积于金电极表面,加快电子转移速率造成的。c比b的氧化峰电流明显减小,主要是由于固定葡萄糖氧化酶后,使电极表面电阻增大,电流减小造成的 。图1不同修饰电极循环伏安图2.2pH的影响图2给出了溶液pH对电极电流响应的影响曲线,从图可以看出从4.5开始随着pH的升高,传感器响应电流相应增大,当pH为7.0时,传感器的响应电流达到最大,说明该传感器的最佳pH为7.0。因此实验选择pH7.0的磷酸盐缓冲液作为底液 。图2pH的影响2.3温度影响图3给出了温度对酶电极电流响应的影响曲线。可以看出,当温度升高到60的时候,电流响应值仍呈升高趋势,表明采用上述固定方法可以在很宽的温度范围内

13、保持酶的活性,扩大了酶电极的使用范围,在实际测量中,567传感技术学报第23卷我们使用的温度是35,该温度与人体体温相当,接近实际测量的温度。 图3溶液温度对电极电流影响2.4电流时间曲线灵敏度和响应时间是传感器的两个重要的参数,实验采用电流时间曲线进行测定。所用电解质溶液为0.1mol/L 的P BS (pH 7.0,通过磁力搅拌实现液体对流。测试时,工作电位设为0.4V ,每次待i 2t 曲线平稳后连续加入一定体积的10mmol/L 的葡萄糖溶液记录电流变化。图4为传感器对葡萄糖溶液进行测试时得到的i 2t 曲线,从图中可以看出连续加入葡萄糖后,酶电极的响应电流较大,而且响应电流的稳定性很

14、好。从电流时间曲线的局部放大图(图5中可以看到,酶电极具有很好的响应速度,加入底物后响应电流能很快达到平衡,平均响应速度约8S 左右。 图4传感器对葡萄糖响应的i -t曲线图 图5时间电流的局部放大2.5酶电极的线性线性检测范围和检测极限也是传感器的两个重要的参数,通过不同浓度的葡萄糖溶液获得不同大小的响应电流而绘制出该传感器的校正曲线(图7。从图6可以看出,随着底物葡萄糖浓度的不断增高,传感器氧化峰响应电流不断增大,而还原峰响应电流不断减小。酶电极的响应电流与葡萄糖浓度在1×10-51×10-3mol/L 的浓度范围内呈线性关系,线性回归方程为y =0.00662x +0

15、.32037(x 葡萄糖的浓度mol/L;y 响应电流,A ,R 2=01997。该传感器的检测限根据公式18(1dl =3Sb /m (1式中dl 为检测限,Sb 为平衡电流的标准偏差,m 为校正曲线的斜率值,检测限计算值为1.4×10-5mol/L (S /N =3.0米氏常数K m app是酶促反应的特征动力学参数,是表征酶活性物质与底物之间亲和力大小的统计标准,表观米氏常数可以根据Shu 和W ils on 19提出的电流法求得(公式21I ss =K m I max 1C -1I max(2其中:I ss 为稳态电流,I max 为最大电流,K m 为表观米氏常数,C 为葡

16、萄糖的浓度。酶电极的米氏常数经计算为1.19mmol/L,此处表观米氏常数K m 远远小于文献中所报道的值20,表明用该方法制作的传感器对葡萄糖氧化酶具有更大的亲和力。图6生物传感器在不同浓度的葡萄糖溶液中的循环伏安曲线图图7酶电极的校正曲线2.6酶电极的稳定性将该传感器在5×10-3mol/L 的葡萄糖中重复测定10次,其相对偏差为3.8%,该传感器使用20667第6期范增杰,马莉萍等:基于静电沉积壳聚糖铂纳米颗粒复合膜构建葡萄糖生物传感器天后,响应电流仍保持在80%左右,这可能是由于壳聚糖具有良好的生物相容性,能够很好的保持酶的活力。该传感器不用时,悬于4的磷酸盐上方保存。3结论

17、研究表明:通过静电沉积能够将含铂纳米颗粒的壳聚糖溶液组装到电极表面,成膜后具有很好的化学稳定性。通过戊二醛交联的方式固定葡萄糖氧化酶,制得的葡萄糖传感器能够固定并保持酶的活性,该传感器具有灵敏度高,响应迅速,稳定性好等优点。传感器的制作简单,使用方便。参考文献:1Pei J H,F Tian,T Thundat .Glucose B i osens or Based on the M i 2 cr ocantileverJ .Anal .Che m 2004,76(2:292-297.2刘春秀,刘红敏,蔡新霞.基于纳米铂黑修饰的快速检测用乳酸生物传感器研究J .分析化学,2009,37(4:6

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