染料木素影响MRSA蛋白表达的差异性分析及相关耐药蛋白介导细菌耐药的机制

1、染料木素影响MRS糜白表达的差异性分析及相关耐药蛋白介导细菌耐药的机制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA足医院感染中最常见的致病菌之一,由于广泛且不合理的使用抗生素，MRSA勺耐药性问题日益严重。已有的研究表明,MRSA勺主动外排系统和生物被膜的形成是导致其产生多重耐药的主要原因。其中,主动外排系统和生物被膜的形成均与耐药蛋白有关。本实验室前期研究结果也证明,染料木素中药单体化合物能显著抑制MRSAS白的表达量,由此推测其对MRS的抑制作用与蛋白有关，但关于染料木素作用MRS府，菌体蛋白的变化尚不清楚。因此，本文通过iTRAQ技术检测了染料木素作用MRS质菌体蛋白表达量的变化;并通过生物信息学

2、分析方法,对差异显著的蛋白在分子功能、生物学进程、所处细胞位置以及所参与的通路等方面的差异进行系统的分析,进而探讨了耐药相关蛋白在介导细菌耐药方面的作用机制。具体的研究结果如下:(1)通过iTRAQ技术，检测染料木素作用MRSAI菌体蛋白的表达差异。实验结果显示,样品共检测到1312个蛋白,与对照组相比,差异显著蛋白共有129个,包括60个表达上调的蛋白和69个表达下调的蛋白;(2)通过qRT-PCR法，检测了差异显著的上调蛋白和下调蛋白的基因表达水平,以验证iTRAQ检测结果的准确性。实验结果显示,与对照组相比,下调蛋白PstB和PstC中的mRNA表达水平明显降低,其基因表达量分别下降了5

3、1.6%和52.1%(P<0.01);上调蛋白SecYMip和RecT的mRNA勺表达量显著性增加，与对照组相比，分别增加了77.2%、87.5%和90.1%(P<0.01)。基因表达水平与蛋白表达水平的变化趋势完全一致，表明本研究的iTRAQ检测结果准确, 可用于后续的生物信息学分析。通过GO KEG住口 String 方法,对染料木素作用MRSA1差异显著蛋白表达的差异性进行生物信息学分析。1)GO分析结果显示,所检测到的129个显著性差异蛋白，主要参与10种生物学过程,按照基因所占比例的高低,这些差异显著蛋白分别参与代谢(80%),细胞(65%)和单有机体(5

4、8%)等过程;主要分布在细胞(46%),细胞组分(44%),细胞膜(22%)等位置；分别执行催化(63%),结合(44%)和转运(10%)等功能。2)KEGGffi路数据库分析结果显示,所检测的129个差异显著蛋白,参与的通路主要包括四大类,分别是代谢通路、遗传信息处理通路、环境信息处理通路和一些未知的通路。其中,代谢通路所包含的差异蛋白数量有50个;遗传信息处理通路有17个;环境信息处理通路所包含的差异蛋白有17个;其他19个差异蛋白参与的通路尚不清楚。3)String分析结果显示,129个差异显著蛋白之间存在直接和间接的相互作用。有的差异蛋白连接密集,有的连接松散。其中,secY、rpsE

5、、isaB和PstB等蛋白与其它蛋白的相互作用关系5,它们是蛋白质相互作用网络的中心节点，在蛋白转运、核糖体合成、细胞免疫以及细菌耐药方面发挥重要作用。(4)对检测出的129个差异显著蛋白,通过分析其分子功能,得到与耐药相关的蛋白,并对其介导细菌耐药的机制进行了探讨。结果显示,与细菌耐药相关的蛋白约有14个，其中,PstB、PstC和PhoU等蛋白主要是通过主动外排系统介导细菌耐药;PstS、altA和sarR等蛋白主要通过促进细菌生物被膜的形成介导细菌耐药。(5)利用蓄积动力学实验、结晶紫半定量法和qRT-PCRfe对PstB和PstS蛋白介导细菌耐药的机制进行了验证。1)蓄积动力学结果显示

6、,Pst系统抑制剂维拉帕米作用MRSA4157菌体后，与对照组相比，菌体内环内沙星的蓄积量明显升高。其中,100?g/ml的维拉帕米作用菌体12min后,环丙沙星的蓄积量比空白对照组增加了32%(P<0.01)。由于PstB是外排泵的组成蛋白,表明维拉帕米逆转细菌耐药可能与抑制PstB蛋白的表达有关。qRT-PCR吉果显示，维拉帕米能抑制pstB基因的表达量。与对照组相比，100Ng/ml维拉帕米作用MRSA41577体16h后,pstB基因的表达量降低了89%(P<0.01)。表明维拉帕米可通过抑制pstB的mRNAfe达量来逆转MRSA4157耐药。2)结晶紫半定量结果显示，维拉帕米对MRSA4157生物被膜的形成和成熟的生物被膜均有一定的抑制作用。与对照组相比，100Ng/ml的维拉帕米可使游离细菌和成熟生物被膜内细菌的数量均减少约25%(P<0.05)。qRT-PCR吉果显示，维拉帕米能抑制pstSmRNA的表达量。与对照组相比，100仙