骨调素对巨噬细胞在新月体肾炎肾脏组织局部浸润的影响

1、    骨调素对巨噬细胞在新月体肾炎肾脏组织 局部浸润的影响        目的观察骨调素(OPN)在大鼠实验性新月体肾炎肾脏组织中的表达及功能性抑制OPN的活性对巨噬细胞在肾脏局部浸润的影响。方法OPN在肾脏组织蛋白和基因水平的表达分别应用免疫组化双标记及原位杂交技术。结果在实验性新月体肾炎肾脏组织内OPN的表达明显升高，并与肾脏局部巨噬细胞的浸润、肾脏病理损害程度及肾功能的下降明显相关。应用抗OPN抗体治疗以后可显著抑制OPN在肾脏组织的表达，同时巨噬细胞在肾脏

2、组织局部的浸润也明显减少，肾脏病理损害减轻、肾功能明显改善。结论OPN的高表达是实验性新月体肾炎发病过程中巨噬细胞在肾脏组织局部浸润的重要介导因子，抑制OPN的表达和功能可显著抑制肾脏局部巨噬细胞的聚集及改善肾功能。关键词骨调素巨噬细胞新月体肾炎Osteopontin is the key factor in inducing the macrophage infiltration in rat experimental crescentic glomerulonephritis*Yu Xueqing,Sun Yuling,Mu Wei，et al.* Department of Nephro

3、logy,The First Affiliated Hospital,Sun Yat-Sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510089ObjectiveTo investigate the role of osteopontin in the accumulation of macrophages in rat experimental crescentic glomerulonephritis.MethodsDouble labelling immunostaining and in situ hybridization.ResultsO

4、steopontin expression was highly increased in the glomerular and tubulointerstitial area,and closely correlated with the proteinuria and damaged renal function,especially macrophage infiltration.Anti-OPN treatment significantly inhibited the macrophages infiltration and glomerular injury and prevent

5、ed a loss of renal function.ConclusionOPN plays an important role in inducing macrophage infiltration and accumulation in a rat model of crescentic glomerulonephritis.Key wordsOsteopontinMacrophageCrescentic glomerulonephritis骨调素(osteopontin OPN)是一种可由多种细胞如破骨细胞、肾脏Henles袢降支厚段小管上皮细胞和巨噬细胞等分泌的类细胞因子的磷脂蛋白，

6、是一种强大的单核-巨噬细胞化学趋化因子和粘附分子1。Singh等的体外研究证实2，OPN和巨噬细胞具有很强的亲和力；注射纯化的OPN于皮内，可引起明显的巨噬细胞的局部浸润。Giachelli等的研究也证实3，4，在免疫和非免疫因素介导的肾脏损伤中，肾小管细胞OPN的高水平表达和管周局部的巨噬细胞浸润密切相关。然而，在进行性肾脏损伤发展过程中，肾小球内实质细胞OPN的表达如何及其与巨噬细胞在肾脏局部的浸润、肾小球新月体形成的关系目前尚不明确。我们首次探讨OPN在大鼠实验性新月体肾炎发展过程中的表达以及功能性抑制OPN的活性对巨噬细胞在肾脏局部浸润的影响，旨在进一步证实OPN在肾小球肾炎发病机制中

7、的作用。 材料和方法一、实验材料Sprague-Dawley大鼠30只，体重150200g。功能性阻断OPN活性用的多克隆抗体为羊抗鼠OPN抗体，免疫组化染色则用单克隆抗体(MPB10，小鼠抗OPN抗体)均由美国Johnson教授惠赠；ED1(抗CD68、识别巨噬细胞)应用本实验室的杂交瘤细胞株制备；免疫组织化学染色试剂羊抗小鼠过氧化物酶(HRP)、小鼠抗过氧化物酶(PAP)、羊抗鼠碱性磷酸酶(AP)及抗碱性磷酸酶(APAAP)购于Dako公司；兔抗鼠肾小球基底膜肾毒性血清(NTS)由本实验室制备。二、加速型肾毒性血清性肾炎模型的制作所有大鼠随机分为3组：(1)模型组18只(分别于3小时、第1

8、天、第7天杀检)；(2)抗OPN治疗组6只(腹腔注射羊抗鼠OPN抗体，50mg/kg体重，治疗后第7天杀检)；(3)正常对照组6只。所有的实验组动物(正常对照组除外)应用正常兔IgG(5mg/只)加完全弗氏佐剂皮下注射进行预免疫，5天后经尾静脉注射兔抗鼠肾小球基底膜的肾毒性血清(10ml/kg体重)。抗OPN治疗组在注射NTS前2小时预先注射首次剂量的抗OPN抗体。模型组和治疗组分别于第0、第1和第7天收集24小时尿、血标本。三、检测指标和方法24小时尿蛋白和尿肌酐定量以及血肌酐和尿素氮的检查送临床实验室用常规方法检测。内生肌酐清除率根据经典公式计算。OPN在肾脏组织中的表达和巨噬细胞的浸润应

9、用单克隆抗体(抗OPN、ED1)检测，OPN mRNA的检测应用非同位素标记的原位杂交技术。此外，OPN的表达与巨噬细胞浸润的关系则应用微波炉免疫组织化学双标记染色方法5。四、免疫组织化学染色PLP固定组织冰冻切片(6m)或bouin固定的蜡块切片(4m)，凉干后用10%正常羊血清(NGS)和10%的小牛血清(FCS)磷酸盐缓冲液(PBS)孵育20分钟，然后加单克隆抗体60分钟。PBS冲洗后，用含0.3%过氧化氢的甲醛阻断内源性过氧化物酶20分钟。然后用兔抗小鼠IgG连接的过氧化物酶及小鼠PAP。最后用DAB显色。双重染色者，则先用微波炉(0.01mol/L的枸橼酸缓冲液，pH 6.0，2 4

10、50mHz,2×5分钟)处理以防抗体之间的交叉显色，其余步骤同前。最后在光镜下计算每个肾小球和单位面积肾小管间质内阳性细胞的个数和百分数。肾小球新月体的形成和小管间质的损害用常规HE染色方法。五、原位杂交福尔马林固定组织切片(4m)脱腊后，微波炉处理2×5分钟，0.2mol/LHCL孵育15分钟，接着用磷酸盐缓冲液冲洗，再用蛋白酶K消化(德国Boehringer Mannhein公司，10g/ml)室温20分钟。然后用2×SSC液冲洗后，预杂交，接着用地高辛标记的顺义和反义的cRNA探针在50%去离子的Foramide，4×SSC、2×Denh

11、ardt溶液，1mg/ml鲑鱼精DNA(Sigma公司)和酵母tRNA(德国Boehringer Mannhein公司，1mg/ml)，最后在42用0.1×SSC冲洗。杂交的探针用碱性磷酸酶标记的羊抗地高辛IgG连接，并用氮蓝/X-磷酸化合物(内含2mol/L左旋咪唑)显色，套染PAS后封片。六、染色细胞的计数每个模型的肾脏组织切片在高倍镜下计算20个肾小球相关抗体阳性细胞及mRNA阳性细胞数的平均数，即每个肾小球的平均数。小管间质的浸润细胞数则计算50个高倍视野的总和，即为阳性细胞数/mm2。OPN在肾小管的表达则计算50个高倍视野下阳性肾小管与总肾小管数的百分数。七、统计方法所有

12、资料用平均数±标准差(±s)表示，并在GraphPad Prism(美国微软公司)统计软件程序下操作，以P0.05为有统计学差异的标准。结果一、正常大鼠肾脏组织OPN的表达在正常肾脏组织，肾皮质部仅在部分肾小球鲍曼囊的侧壁上皮细胞有少量OPN表达，肾小球毛细血管袢无OPN的表达(插页附A，)；小管-间质区仅极少数的远曲小管上皮细胞可有少量的OPN的表达；在肾髓质，肾小管和集合管均有较强的OPN表达。二、新月体肾炎模型肾脏组织中OPN的表达在新月体肾炎模型，皮质肾小管在注射兔抗鼠肾毒性血清后3小时即有OPN的轻度表达，且早于巨噬细胞在肾脏组织浸润(注射肾毒性血清12小时后方有

13、巨噬细胞的浸润)，而此时肾小球毛细血管袢则无明显表达。随着疾病的进展，肾小球鲍曼囊侧壁上皮细胞和皮质肾小管上皮细胞OPN表达均明显增高，同时，部分肾小球有少量的OPN表达，并随着疾病的进展而逐渐增高，在第14天时则有广泛的OPN阳性细胞的浸润(插页附B、E)。特别是新月体形成的部位，有OPN阳性的细胞明显堆积，在新月体形成以后，OPN阳性细胞仍然在局部聚集(插页附E)。而在无新月体形成的部位，OPN阳性的细胞明显减少或缺如。在肾小管间质，注射肾毒性血清3小时后，皮质部远曲小管即有OPN的表达，而此时无明显的巨噬细胞的浸润。随着疾病的进展肾小管OPN的表达明显增强，尤其是有病变的肾小管(肾小管炎

14、症、扩张和萎缩)其OPN的表达更为显著，并呈局灶性分布(插页附D)，而无病变的肾小管则无明显的OPN表达。同时，我们原位杂交的结果显示，OPN阳性的肾小管细胞，其OPN mRNA的表达也明显增高，表明局部OPN的表达是其自身细胞分泌而非血循环的OPN经肾小球滤过后在肾小管管壁的吸附或管周细胞如巨噬细胞等分泌的OPN在肾小管细胞粘附的结果。三、OPN与肾小球、小管间质巨噬细胞浸润的关系巨噬细胞在肾脏组织局部的浸润并介导肾脏损伤是本模型的重要特征。我们的研究结果显示，肾小球内OPN+的细胞与肾小球内ED1+的浸润明显相关，见表1，并在新月体形成的部位聚集(插页附E)。上述现象表明，OPN和肾小球内

15、细胞性新月体的形成密切相关。在小管间质，肾小管OPN的表达与局部巨噬细胞的浸润呈局灶性分布，在OPN表达的部位，有明显的巨噬细胞的局部浸润，而无OPN表达的肾小管间质，巨噬细胞明显减少或缺如(插页附D)。表1肾小球和小管间质OPN及ED1的表达部位模型组抗OPN治疗组d7正常对照组3hd ld7肾小球ED1+/gcs2.2±1.18.7±1.7*11.6±2.1*7.3±1.5*2.2±0.4OPN+/gcs0.5±0.1*2.0±0.3*6.1±2.6*3.0±1.1*0肾小管间质ED1(/mm2)55

16、.3±9.1202.6±35.8*224.7±54.8*163.9±18.9*56.8±12.5OPN(/%)6.4±2.5*20.7±1.4*51.5±5.8*18.6±7.4*1.6±0.5注：与正常组比，* P0.01；与3h组比，P0.01；与d l组比， P0.01；与d7组比， P0.01 表2肾小球和小管间质EDI及OPN的表达与肾功能的相关关系(r值)部位ED1OPNCcr蛋白尿肾小球ED1-0.94*0.65*0.61*OPN-0.540.53肾小管间质ED1-0.93*0.5

17、9*0.58*OPN(%)-0.52*0.61*注：* P0.001， P0.01四、抗OPN治疗对巨噬细胞在肾脏组织局部浸润的影响抗OPN治疗以后可明显抑制大鼠模型肾脏组织肾小球及小管间质内OPN的表达，同时明显减少巨噬细胞在肾小球及小管-间质的浸润(插页附F)，两者之间具有明显的相关关系，见表2。此外，原位杂交结果显示，抗OPN治疗组肾脏实质细胞OPN mRNA的表达也明显降低(插页附C)。 讨论正常肾脏组织OPN的表达较少，主要见于肾髓质部的肾小管、集合管和髓袢。皮质部仅见于少部分的球囊侧壁上皮细胞和极少部分的远端小管的少量表达。肾小球内罕有OPN的表达。在新月体肾炎模型，肾脏组织OPN

18、的表达随着疾病的进展而明显增强，并与巨噬细胞在肾小球和小管间质的浸润、肾小球新月体的形成以及肾小管间质的损伤明显相关。尽管OPN在维持肾脏生理功能及如何参与肾脏疾病病理生理过程的机制尚未明了，但上述结果提示肾脏组织细胞OPN的过度表达在巨噬细胞介导肾脏损伤为主的新月体肾炎的发病机制中发挥着重要作用。已有的研究表明，OPN可由多种细胞合成和分泌包括肾小管上皮细胞等，具有典型的精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸的粘附分子结构1。体外研究证实，OPN是一种强大的单核细胞/巨噬细胞趋化因子和粘附分子，对巨噬细胞具有强大的亲和力2。皮下注射纯化的OPN可产生皮肤巨噬细胞浸润为主的炎症反应，更进一步支持OPN确具

19、有粘附分子的功能及与巨噬细胞的强大结合能力。同时，亦有学者证实6，OPN可以促进体外培养的纤维母细胞、破骨瘤细胞及平滑肌细胞的粘附。我们的研究结果证实，在新月体肾炎发展过程中，随着疾病的进展，肾小球内OPN细胞逐渐增多，并和肾小球局部巨噬细胞的浸润密切相关。双标记免疫组化染色显示，在新月体肾炎的第1天肾小球内OPN+ED1+的巨噬细胞即逐渐增多，并主要位于新月体形成的起始部位。随着疾病的进展，肾小球内聚集的OPN+ED1+细胞明显增多，并在新月体形成以后，仍然在局部聚集。表明OPN在新月体肾炎发病过程巨噬细胞在肾小球局部的浸润及细胞性新月体的形成过程中发挥重要作用。在肾小管间质，OPN在注射兔

20、抗鼠肾毒性血清后3小时远曲小管即有明显的表达，并早于巨噬细胞在局部的浸润。既往的研究已经证实，在本模型巨噬细胞在注射肾毒性血清12小时才在肾脏局部浸润7。同时，我们还观察到，OPN表达增强的肾小管，其周围有较多的巨噬细胞浸润，而无OPN表达的肾小管周围，则无或仅有少量的巨噬细胞浸润，提示OPN的高表达有助于巨噬细胞在局部的浸润。Giachelli等也发现OPN在多种类型的肾小球肾炎模型及梗阻性肾病模型小管间质损伤过程中发挥重要作用3，4，8。同时，我们的原位杂交结果进一步证实，OPN蛋白表达水平较高的肾小管其OPN mRNA的表达明显增高，表明肾小管局部增高的OPN的表达，是肾小管上皮细胞自身

21、分泌的，而并非通过血循环或临近细胞分泌后粘附在其表面。此外，OPN表达阳性的肾小管多为已经损伤的肾小管，而且早于肾小管损伤的出现，强烈提示OPN的表达可能是肾小管损伤的早期标志，而肾小管OPN的表达与巨噬细胞在同一部位的局部浸润提示OPN可能有助于巨噬细胞在损伤的肾小管间质部位的浸润。抗OPN治疗以后，肾脏组织包括肾小球和小管间质OPN蛋白及基因表达均明显降低，巨噬细胞在肾脏组织的局部浸润亦明显减少，上述改变和尿蛋白的减少、肾功能的改善明显相关。但应用抗OPN治疗仅能部分抑制巨噬细胞在肾脏组织的局部浸润，除与抗OPN治疗仅能部分抑制OPN的活性有关外，可能还有其它因素的参与；在我们的研究中，我

22、们还观察到，抗OPN治疗并不影响细胞间粘附分子(ICAM-1)的表达，提示抗OPN治疗并不影响巨噬细胞从血管到肾脏的转移，而可能主要是介导巨噬细胞进入肾脏以后的聚集和粘附。上述研究提示，OPN的高表达是抗GBM肾炎发病过程中巨噬细胞在肾脏组织局部浸润的重要介导因子，抑制OPN的表达和功能可显著抑制肾脏局部巨噬细胞的聚集及改善肾功能。根据上述研究结果，我们认为OPN在新月体肾炎发生发展机制中确实发挥着重要作用，抗OPN抗体治疗对于抗GBM肾炎及其它类型的肾小球肾炎可能具有潜在的临床治疗价值。(本文附见插页)参考文献1Bulter WT.The nature and significance of

23、 osteopontin.Connect Tissue Res,1989,23:123127.2Sigh RP,Patarca R,Schwartz J,et al.Definition of a specific interaction between the early T lymphocyte activation 1(Etal) protein and murine macrophage in virto and its effect upon macrophages in vivo.J Exp Med,1990,171:19311942.3Giachellia CM,Pichelli R,Lombardi D,et al.Osteopontin expression in angiotensin -induced tubulointerstitial nephritis.Kidney Int,1994,45:515519.4Pichelli R,Giachellia CM,Lombardi D,et al.Tubulointerstitial disease in glomerulonephritis.potential role of osteopontin (uropontin).Am J Pathol,1994,144:91