非病毒载体负载增强型绿色荧光蛋白转染永生化神经前体细胞

1、非病毒载体负载增强型绿色荧光蛋白转染永生化神经前体细胞    作者：桂伶俐，刘志恒，张传汉，高峰 【关键词】 绿色荧光蛋白质类；,基因表达；,转染；,神经前体细胞 Transfection of enhanced green fluorescent protein into immortalized neural progenitor cells by nonviral vectors 【Abstract】 AIM: To investigate an effective transfection method of nonviral vectors a

2、nd the expression of enhanced green fluorescent protein (EGFP) in the transfected immortalized neural progenitor cells (INPC). METHODS: The plasmid EGFPC1 was transfected into INPC by three different nonviral vectors respectively, including Lipofectamine 2000, TRANSfection and Sofast. The expression

3、 of EGFP and the transfection efficiency of the 3 vectors were measured at 24 h after transfection. The transfection efficiency of the vector which was the most efficient, was detected 12, 24, 48 and 72 h after transfection to determine the expression peak of EGFP. The viability of transfected and n

4、ontransfected cells was measured by trypan blue rejection test. After the plasmid EGFPC1 was transfected into INPC, the stable cell clone designated INPC/EGFP was isolated by G418 selection. The positive rate of EGFP was observed. And the specific molecular marker of neural progenitor cells, nestin,

5、 was detected using immunocytochemistry. After INPC/EGFP was induced by 50 mL/L fetal bovine serum, the cell morphology and the expression of EGFP were observed in the differentiated cells. RESULTS: The transfection efficiency of Lipofectamine 2000, TRANSfection and Sofast was (25.5±2.9)%, (4.0

6、±1.7)%, (7.9±1.4)% respectively, at 24 h after transfection. And Lipofectamine 2000 was the most efficient. Its transfection efficiency at 12, 24, 48 and 72 h after transfection was (17.1±0.7)%, (25.5±2.9)%, (19.4±0.9)%, (15.6±1.4)%, respectively. The expression of EGFP

7、 was the highest at 24 h after transfection. The positive rate of EGFP was 95% in INPC/EGFP. And INPC/EGFP was still nestin positive. The differentiated cells presented as neurons or astrocytes, and EGFP was still found in their somas and processes. CONCLUSION: Extrinsic genes can be effectively tra

8、nsfected into INPC by Lipofectamine 2000. And EGFP is one of the valuable tracking tools for INPC. 【Keywords】 green fluorescent protein; gene expression; transfection; neural progenitor cell 【摘要】 目的: 寻找能高效转染永生化神经前体细胞(INPC)的非病毒载体，观察转染后增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的表达. 方法: 用阳离子脂质体Lipofectamine 2000，TRANSfection或阳离子

9、聚合物Sofast分别负载质粒EGFPC1转染INPC，利用荧光显微镜检测转染后24 h的转染效率. 对转染效率最高的一种载体，观察其转染后12，24，48和72 h转染效率，确定EGFP表达最高峰. 用台盼蓝排斥试验检测转染和未转染细胞的活力. 质粒EGFPC1转染INPC后，经G418筛选，挑选细胞克隆，命名为INPC/EGFP,观察其EGFP阳性率. 应用巢蛋白抗体鉴定INPC/EGFP. 50 mL/L胎牛血清诱导INPC/EGFP分化，观察分化后细胞的形态及EGFP表达. 结果: Lipofectamine 2000，TRANSfection和Sofast转染INPC后24 h，转染

10、效率分别为(25.5±2.9)%，(4.0±1.7)%，(7.9±1.4)%. Lipofectamine 2000的转染效率最高. 其转染后12，24，48和72 h的转染效率分别为(17.1±0.7)%，(25.5±2.9)%，(19.4±0.9)%，(15.6±1.4)%，EGFP在转染后24 h表达最高. INPC/EGFP中，EGFP阳性率约为95%. INPC/EGFP巢蛋白表达阳性，其分化后呈神经元或星形胶质细胞样，且胞体及突起中仍可见绿色荧光. 结论: Lipofectamine 2000可高效转染INPC.

11、 EGFP是INPC理想的示踪方法之一.    【关键词】 绿色荧光蛋白质类；基因表达；转染；神经前体细胞 0引言 永生化神经前体细胞（immortalized neural progenitor cell, INPC）具有自我更新、无限增殖及多向分化的潜能，且较原代神经前体细胞易行基因操作，成为神经系统损伤细胞替代及基因治疗的理想靶细胞1. 而选择高效的外源基因导入系统对基因治疗的效果至关重要. 尽管病毒介导的基因转染具有更佳的转染效率2，但由于其安全性和技术方面的原因,探讨高效率的非病毒载体基因转染方法更具意义. 本实验拟以增强型绿色荧光蛋白(enh

12、anced green fluorescent protein, EGFP)为报告基因， 采用不同种类阳离子脂质体或阳离子聚合物转染大鼠INPC, 检测其转染效率， 并观察EGFP的表达， 以期寻找转染效率较高的非病毒载体及理想的INPC示踪方法. 1材料和方法 1.1材料 Neurobasal，B27添加剂，胎牛血清购自美国GIBCO公司；碱性成纤维生长因子（basic fibroblast growth factor, bFGF）、表皮生长因子（epidermal growth factor, EGF）购自英国PeproTech公司；多聚鸟氨酸、明胶购自美国SIGMA公司； Lipofec

13、tamine 2000购自美国Invitrogen公司；TRANSfection购自北京天为时代公司；Sofast购自北京天来公司；巢蛋白抗体购自美国NeoMarkers公司；免疫组化试剂盒购自北京中山公司；质粒提取试剂盒购自上海华舜公司；携带质粒EGFPC1（美国BD公司）的菌种由同济医院麻醉学教研室保存. 1.2方法 1.2.1细胞培养SV40大T抗原基因转染 原代大鼠神经前体细胞后建立的INPC，由同济医院麻醉学教研室构建并保存1. INPC应用含20 mL/L B27，20 g/L bFGF，20 g/L EGF的无血清Neurobasal培养基，在预先采用10 mg/L多聚鸟氨酸和2

14、 g/L明胶包被的六孔板中贴壁培养. 1.2.2质粒的制备及基因转染 将携带EGFPC1质粒的菌种接种于含氨苄青霉素的LB培养基中，振摇12 h，按试剂盒操作说明提取质粒，采用琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度法确定质粒的纯度与浓度. 分别参照阳离子脂质体Lipofectamine 2000，TRANSfection及阳离子聚合物Sofast的说明书进行转染（转染试剂与质粒按说明书推荐量）. 将两者混合物轻轻滴加于汇合率为80%90%的INPC中，继续培养5 h后换液. 每组设3 个复孔. 转染后24 h，倒置荧光显微镜观察EGFP的表达. 分别记录每个转染细胞培养孔随机5个视野内明视野和暗视野所观

15、察到的细胞数. 转染效率（%）暗视野发绿色荧光细胞数/明视野细胞数×100%. 对转染效率最高的一种载体，在转染后12，24，48和72 h观察转染效率.    1.2.3台盼蓝排斥试验检测 细胞活力取出同期培养的未转染和转染刚结束的细胞培养板，室温下用0.4 g/L台盼蓝溶液染色10 min. 显微镜下随机取培养孔5个视野. 未着色的为活细胞，呈蓝色的为死细胞. 活细胞率（%）活细胞总数/(活细胞总数 死细胞总数)×100%. 1.2.4稳定转染EGFPC1质粒的INPC的筛选及鉴定 EGFPC1质粒经Lipofectamine 2

16、000介导转染INPC后24 h传代，转染后48 h加入G418 200 g/mL筛选14 d，通过倒置荧光显微镜挑选阳性克隆，命名为INPC/EGFP，并计算EGFP阳性细胞百分率. INPC/EGFP行巢蛋白免疫细胞化学染色. 加入50 mL/L胎牛血清诱导INPC/EGFP分化7 d，观察细胞形态及EGFP的表达. 统计学处理： 采用SPSS 11.5统计软件进行统计学分析，实验数据以x±s表示,组间比较用单因素方差分析后Duncan检验，P<0.05为差异有统计学意义. 2结果 2.1非病毒载体转染INPC的转染效率 三种非病毒载体Lipofectamine 2000，

17、TRANSfection和Sofast负载EGFPC1质粒转染INPC后24 h，转染效率分别为(25.5±2.9)%，(4.0±1.7)%，(7.9±1.4)%，组间比较差异均有统计学意义(P<0.05，图1）. Lipofectamine 2000的转染效率最高.    A: 阳离子脂质体Lipofectamine2000; B: 阳离子脂质体TRANSfection; C: 阳离子聚合物Sofast. 2.2Lipofectamine 2000转染INPC后不同时间点的转染效率Lipofectamine 2000

18、转染后12，24，48和72 h转染效率分别为（17.1±0.7）%，（25.5±2.9）%，（19.4±0.9）%，（15.6±1.4）%，组间比较差异有统计学意义(P<0.05）. EGFP表达最高峰在转染后24 h. 2.3转染对细胞活力的影响 台盼蓝排斥试验检测未转染细胞和Lipofectamine 2000，TRANSfection及Sofast转染刚结束后活细胞率，分别是（97.0±1.0）%，（95.7±1.2）%，（96.0±1.0）%，（95.7±0.6）%，组间比较差异无统计学意义(P0.

19、05）.2.4INPC/EGFP中EGFP阳性率转染EGFPC1质粒后，经G418筛选所得细胞克隆INPC/EGFP中，EGFP阳性率约为95%，EGFP荧光均匀地充满胞浆和胞核（图2）. 2.5INPC/EGFP的鉴定及EGFP的表达 INPC/EGFP的细胞形态及生长特性较INPC无明显改变，仍以椭圆形或三角形为主，有23个突起，胞核圆形、较大，而胞质较少（图3A）. 其巢蛋白免疫细胞化学染色仍呈胞浆阳性（图3B）. 其分化7 d后，可观察到大量不同形态的新生神经细胞，呈现为具有12个细长突起的神经元样或多个粗短突起的星形胶质细胞样形态. 荧光显微镜下观察到分化后细胞的胞体与纤细突起仍表达

20、EGFP（图3C）. 3讨论 目前，非病毒转染法中以阳离子脂质体和阳离子聚合物呈现显著优势3-4，影响它们转染效率的因素众多. 本实验中，细胞种类、细胞密度、质粒及转染时间均相同，并参照说明书给予推荐量的转染试剂及质粒DNA,则转染效率主要取决于阳离子脂质体的结构或阳离子聚合物的种类. 本研究采用常用转染试剂阳离子脂质体Lipofectamine 2000，TRANSfection和阳离子聚合物Sofast分别介导INPC的基因转染，发现这三种非病毒载体细胞毒性都很低，且Lipofectamine 2000的转染效率最高，可超过20. 虽然，高峰等2发现利用EGFP重组腺相关病毒转染INPC，

21、可得到高达90的转染效率，但由于其安全性和技术方面的原因, Lipofectamine 2000仍不失为一种有效而简便的转染方法.A: INPC/EGFP细胞形态; B: INPC/EGFP巢蛋白免疫细胞化学染色; C: INPC/EGF分化后荧光显微镜观察EGFP的表达. EGFPC1质粒经Lipofectamine 2000转入细胞后逐步转录翻译EGFP，所以1224 h EGFP表达逐渐升高，到24 h最高，提示INPC瞬时转染后，基因表达检测最好在转染后24 h进行. 但同时，被导入外源基因的靶细胞代谢发生改变,生长缓慢，转染后有些细胞正常分裂,而另一些的细胞周期则延长,这些都影响了转

22、染后瞬时的表达，所以转染后4872 h EGFP表达降低. 而高峰等2发现利用EGFP重组腺相关病毒转染INPC后，EGFP至转染后72 h表达最高. 这说明病毒或非病毒载体所负载的外源基因转染有不同的时程特点. INPC中，虽然非病毒载体的瞬时转染效率不如病毒载体高，但经过抗性筛选可极大提高外源基因的表达，如INPC/EGFP细胞株EGFP的阳性率可高达95%. 这是因为INPC是大T抗原转化细胞，质粒可在细胞中复制, 所以易于筛选出高表达外源基因的稳定细胞克隆.本研究中，EGFPC1质粒转染INPC后，EGFP表达迅速而持久，可反映细胞形态的全貌，能在活细胞中直接观察，具有操作简便、可视性强并且不需要外源底物等优点5-6. EGFPC1质粒导入INPC后，不影响其前体细胞特性，且分化后的细胞不仅胞体而且细小的突起仍可发出较强的绿色荧光. 因此，EGFP可作为INPC良好的示踪手段. 综上所述，本研究证实Lipofectamine