The promotion of cerebral ischemia recovery in rats by laminin

1、层粘连蛋白结合脑源性神经营养因子促进大鼠脑层粘连蛋白结合脑源性神经营养因子促进大鼠脑缺血复苏缺血复苏Page 2n 中国科学院遗传与发育生物学研究所来源来源生物材料（生物材料（BiomaterialsBiomaterials）( (Doi:10.1016/j.biomaterials.2Doi:10.1016/j.biomaterials.2011.03.072011.03.072）Page 3n 脑缺血（脑梗塞）是由于脑动脉狭窄加重或脑缺血（脑梗塞）是由于脑动脉狭窄加重或完全闭塞，导致脑组织缺血、缺氧、坏死，完全闭塞，导致脑组织缺血、缺氧、坏死，从而引起神经功能障碍的一种脑血管病。从而引起神

2、经功能障碍的一种脑血管病。n 脑缺血是很常见的中枢神经损伤，其主要致脑缺血是很常见的中枢神经损伤，其主要致病因素有：高血压病、冠心病、糖尿病等，病因素有：高血压病、冠心病、糖尿病等，多见于多见于4570岁中老年人。岁中老年人。n 生存下来的脑缺血损伤病人大都会有后遗症，生存下来的脑缺血损伤病人大都会有后遗症，影响正常生活，严重的脑缺血病人生活不能影响正常生活，严重的脑缺血病人生活不能自理甚至危及生命安全。自理甚至危及生命安全。n 中枢神经再生是再生医学的研究热点之一。中枢神经再生是再生医学的研究热点之一。病况简洁病况简洁Page 4脑源性神经营养因子（脑源性神经营养因子（BDNF）对神经元的缺

3、血性损伤具有）对神经元的缺血性损伤具有防治作用防治作用, 可望成为新一代的缺血性脑血管病的有效治疗药可望成为新一代的缺血性脑血管病的有效治疗药物。但因物。但因BDNF 属蛋白质大分子物质属蛋白质大分子物质, 难透过血脑屏障难透过血脑屏障, 为此为此影响了其临床应用影响了其临床应用。层粘连蛋白层粘连蛋白(Laminin）一种丰富的细胞外基质一种丰富的细胞外基质。在中枢在中枢神经系统中，脑缺血后神经系统中，脑缺血后在在缺血区域缺血区域高度表达。高度表达。我们这里融合层粘连蛋白结合域我们这里融合层粘连蛋白结合域（laminin-binding domain，LBD,NtA插入插入pET-28a形成形

4、成PET-LBD)和和BDNF形成形成LBD-BDNF。LBD-BDNF可以针对累积层可以针对累积层粘连蛋白粘连蛋白，在缺血区在缺血区，发挥靶向治疗缺血损伤后神经发挥靶向治疗缺血损伤后神经元。元。名词介绍名词介绍Page 5LBD-BDNF的构造的构造n Gene of NtA was constructed and inserted into pET-28a (Novage, San Diego, CA) to construct pET-LBD as described before.n A human BDNF DNA was amplified by PCR as described

5、before.n The BDNF DNA fragments were inserted individually into pET-LBD and pET-28a to construct the expression vectors for BDNF with LBD (pET-LBD-BDNF) or without LBD (pET-NAT-BDNF). n E.coli BL21 (DE3) strain-carried pET-LBD-BDNF or pET-NAT-BDNF were cultured.Page 6检测纯化检测纯化n The expression of reco

6、mbinant proteins was analyzed by electrophoresis on a 15% (wt/vol) sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) under reducing condition and western-blotting with mouse antibody to polyhistidine (1:1000 dilution; Sigma).n The purified NAT-BDNF or LBD-BDNF was refolded in the

7、glutathione redox-refolding system, and stored at 80 C.Page 7模拟模拟Page 8体外电泳分析层粘连蛋白结合能力体外电泳分析层粘连蛋白结合能力通过十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（通过十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）测定纯化的）测定纯化的NAT-BDNF和和LBD-BDNF 。使。使用用ELISA分析以确定是否分析以确定是否LBD-BDNF具有层粘连蛋具有层粘连蛋白结合能力。在每个指示的点，在白结合能力。在每个指示的点，在OD 405 nm处的处的LBD-BDNF为显着高于的为显着高于的NAT-BDNF，表明，表明

8、LBD-BDNF对层粘连蛋白对层粘连蛋白结合能力大于结合能力大于NAT-BDNFPage 9体内体内n 外科手术外科手术（封堵装置送到前动脉）（封堵装置送到前动脉）对大鼠脑缺血模型的永对大鼠脑缺血模型的永久性大脑中动脉闭塞（久性大脑中动脉闭塞（MCAO），制备了大鼠大脑中动脉制备了大鼠大脑中动脉堵塞的脑缺血模型堵塞的脑缺血模型24只大鼠只大鼠control组组NAT-BDNF组组LBD-BDNF组组Page 10层粘连蛋白在体内的结合分析层粘连蛋白在体内的结合分析Page 11神经元退化分析神经元退化分析一周后，一周后，LBD-BDNF治疗组脑缺血大脑半球的梗塞面积显治疗组脑缺血大脑半球的梗塞面积显著减少；四周后，海马区域神经发生明显增强，神经行为著减少；四周后，海马区域神经发生明显增强，神经行为能力明显恢复。这一系列结果表明：能力明显恢复。这一系列结果表明：LBD-BDNF可以通过可以通过结合于脑缺血部位的层粘连蛋白来发挥其定向的神经营养结合于脑缺血部位的层粘连蛋白来发挥其定向的神经营养作用，促进脑缺血损伤的恢复。作用，促进脑缺血损伤的恢复。Page 12总结总结