基因治疗在心肌缺血再灌注损伤中的研究进展_图文

1、基因治疗在心肌缺血再灌注损伤中的研究进展孙智慧综述; 郑良荣 审校摘要:通过溶栓和经皮冠状动脉血管成形术达到再灌注是即将发生急性心肌梗死的标准处理措施。 尽管缺血区的血流复灌对心肌的挽救具有重要意义,再灌注本身可能导致缺血损伤基础上的进一步心 肌损伤。目前对心肌缺血再灌注损伤分子和细胞机制的更深理解以及心血管系统基因操作工具的利 用,为基因治疗提供了可能性。为了提高人类血管基因治疗的有效性和安全性,对基因转导载体,基因 递送技术和有效治疗摹闪的鉴定等方面的基础研究是非常必要的。关键词:缺血再灌注损伤;基因治疗;心肌保护中图分类号:R543.2:Q78文献标识码:A文章编号:10042369(2

2、00902-0069-05Research advancement of gene therapy for the myocardial ischemia and reperfusion injury SUN Zhi hui,ZHENG Liangtong.Department of Cardiology,The First Affiliated Hospital of Zhejiang University,Han gzhou 310003。China;Corresponding author。Email:zlrylnn126.cornAbstract:Reperfusion through

3、 thrombolysis or percutancous coronary angioplasty is standard treatment in im pending acute myocardial infare“orL Although restoration of blood flow to the ischemic area is beneficial for myocardial salvage,reperfusion itself may lead to accelerated myocardial injury beyond that generated by ische-

4、mia alone.Recent advances in understanding the molecular and cellular mechanisms of myocardial ischemia and reperfusion injury.together with the availability of tools for genetic manipulation of the cardiovascular sys-tern,offer possibilities for gene therapy.Further basic research on gene transfer

5、vectors,gene delivery tech niques,and identification of effective treatment genes is needed to improve the efficacy and safety of human vascular gene therapy.Key words:lschemia and reperfusion injury;Gene therapy;Myocardial preservation(IntJ Intem Med,2009,36:6973冠状动脉搭桥术、经皮穿刺腔内冠状动脉成形术及溶栓术等心脏介入性治疗大量开

6、展,造成的缺血再灌注(Ischemia-reperfusion,I.R损伤也越来越引起关注。对心肌缺血和心室重构中基因表达改变的研究为再灌注损伤的基因治疗奠定了基础。IR损伤的调控机制复杂多样,因此,其基因治疗的策略也是多种多样的。随着从分子和细胞水平对心肌I-R损伤机制研究的深入,已开展运用基因导入的方法治疗I.R损伤达到心肌保护的目的。本文主要介绍基因治疗在IR损伤治疗中的应用进展及目前面临的问题。1伴随心肌缺血的基因改变基因芯片的出现使得监测心脏中大量基因表达 69水平的变化成为可能,在急性心肌缺血模型中用芯 片技术研究心肌缺血后基因表达的变化情况,他们 发现在急性心肌缺血的心肌中热休克

7、蛋白(HSPs、 血管内皮生长因子(VEGF、脑源性神经生长因子、 纤溶酶原激活物抑制剂1、转录激活因子3(Aft3、B 细胞迁移因子2(Bt92、生长停滞与DNA损伤诱导 蛋白45a(Gadd450t表达水平增高引。心肌缺血 时表达增加的HSPs已被证实可以增强心肌对缺血 损伤的抵抗,促进心肌缺血后恢复一J。脑源性神经 营养因子表达上调可以保持缺血心肌神经结构稳定 性。Das等M o人发现缺血时刺激VEGF表达可以增 加缺血组织的血管再生。Atf3(也称肝细胞生长因 子可以抑制阿霉素诱导的凋亡,这种潜在的凋亡收稿日期:2008-08.13;修回日期:2008.12.10基金项目:浙江省科技攻

8、关计划(2006C33010作者单位:浙江大学医学院附属第一医院心血管内科.浙江杭州310003通讯作者。E-mail:zhylnn126.eom70抑制作用对缓解缺血损伤,还有充血性心力衰竭的 治疗有着重要意义【5J。纤溶酶原激活物抑制剂1是种丝氨酸蛋白酶抑制剂具有抗凋亡特性,Bt92是 细胞存活促进因子,Gadd45et控制DNA修复、基因 组稳定性和细胞对应激拮抗作用,他们都将参与因 缺血再激活的细胞存活程序旧J。2基因治疗的策略2.1外源性基因过表达策略某些疾病导致体内某些基因活性的缺失或衰 减,通过载体将编码这些活性减退或缺失的基因的 eDNA导入机体并使其过表达,来恢复机体的正常

9、功能或扭转疾病的进程。同时一些具有细胞保护或 特殊功能的基因也可以使其过表达来起到类似“功 能获得”效果旧J。2.2基因沉默策略2.2.1RNA干扰(RNAi技术:是近年发展起来的 一项新技术,是一种有效的特异的基因沉默过程。 通过导人一小段双链小干扰RNA(Small interference RNA,siRNA,在细胞内裂解为单链反义寡聚脱氧 核苷酸并与目的mRNA特异性结合而使其降解,进 而阻断目的mRNA的表达。2.2.2反义疗法:即根据靶基因的结构特点设计反 义寡核苷酸(Antisense oligodeoxynucleotide。 ASODN分子,通过静脉注射或靶组织局部注射将 A

10、SODN直接导入或以病毒为载体转染到体内,与目 的mRNA互补结合,抑制靶基因表达。2.2.3转录因子诱饵途径:导入一段双链“诱饵” 寡核苷酸,这段寡聚核苷酸携带有特定转录因子的 DNA结合位点,该转录因子就会与“诱饵”核苷酸结 合位点结合而不与靶基因的启动子区域结合,进而 控制靶基因的转录活性。许多基因可能会具有共同 的转录因子,同时一个基因也可受多个转录因子的 调控,因而这个方法缺乏特异性。3基因治疗的载体目前所用载体可分为两类:病毒和非病毒载体。 重组病毒载体在心血管病基因治疗中应用较广泛, 包括逆转录病毒载体、腺病毒载体、重组腺病毒载 体,腺相关病毒载体、慢病毒载体、单纯疱疹病毒载 体

11、等。非病毒载体主要包括阳离子脂质体、日本血 凝病毒脂质体和裸质粒。由于内皮细胞的选择性通 透以及基底膜对一些载体扩散的限制的存在,使得 利用各种载体将靶基因导人心血管组织的有效性和 特异性至今仍是个问题。近年来以导管技术为核心 的基因递送方法使心血管疾病基因治疗的lI缶床应用 成为可能。4缺血再灌注损伤的基因治疗4.1抗炎症策略核因子KB(NFKB通过促进炎症因子和黏附 分子的表达在心肌炎症中起作用。心肌细胞发生I-R时就会激活NFKB,NF-KB的激活在缺血发生不 久就会启动并在再灌注时增强07|。I.R损伤中NF KB间接性介导白细胞与血管内皮细胞结合是心脏 I.R损伤的关键一步。NF.K

12、B与目标(细胞因子基 因的启动子结合,从而激活以下促炎症细胞因子蛋 白质的基因:白细胞介素(IL.1、IL-6、IL-8、细胞间 黏附分子(ICAM、血管细胞黏附分子(VCAM和上 皮白细胞黏附分子(ELAM,表达出这些基因产物 引起炎症反应,促使白细胞与内皮黏附造成心肌损 伤。人工合成双链寡DNA(ODN作为诱饵(Decoy 与NF-KB结合,阻止NF-KB与细胞因子基因启动子 结合,进而阻止上述细胞因子的产生。Morishita 等o用脂质体将外源性含有转录因子结合序列的 诱杀寡聚核苷酸导人到小鼠心脏冠状动脉中进而抑 制NF.KB与DNA的结合。结果可使心肌梗死面积 减小几乎50%,使IL

13、-6和VCAM的水平减低到几乎 测不出水平。实验证明ODN显著抑制了心肌IR 损伤必需的细胞因子和黏附分子基因的转录激活, 从而减小梗死面积。这种抑制是诱饵ODN对NF KB的特异性抑制,并再次证明NF.KB是I.R损伤的 关键性调节物质。I-R后上调转化生长因子Bl(TGF.p1的表达 会加重梗死后炎症反应,抑制TGF.IBl/Smad信号传 导通路可以减少IR诱导的左室纤维化和左室重 构一1。已证明一氧化氮(NO可以抑制血管内皮细 胞内的TGF.131/Smad激活引。故N0介导的TGF. Bl表达抑制可在调节心肌炎症和心肌重构中发挥 重要的作用。组织激肽释放酶Kallikrein可通过其

14、 做用产物激肽于激肽B2受体结合间接引起NO升 高,因此推测Kallikrein可能通过促进NO的形成和 激肽B2受体的激活,及抑制NF-KB的激活起到心 肌保护作用。Yin等证实Kallikrein的心肌保护 作用是通过NO介导的,他们将构建好的携有人 Kallikrein基因的腺病毒通过导管法注入冠状动脉 内。结果证实了Kallikrein基因导入可显著抑制I.R 损失后的心肌炎症反应,提高NO和cGMP水平,减 小梗死面积。该研究证实了Kallikrein的心肌保护 作用,提出了一种新的基因治疗I.R损伤策略。 4.2抗自由基策略超氧化物歧化酶(SOD具有清除体内氧自由基 保护细胞不受毒

15、性氧自由基损伤的作用。Agrawal 等引构建了编码有人细胞外超氧化物歧化酶(Ec-SOD基因的腺相关病毒载体,并将其通过心室游离 壁多点注射的方法导人大鼠心肌细胞。6周后做I. R损伤处理,研究发现导入SOD基因后显著减少大 鼠IR后心肌梗死面积,长期改善心功能,并能显著 提高生存率。还发现没有导人SOD组的大鼠心肌 在急性I-R损伤后有大量CIM5阳性白细胞浸润, 而导人组则明显减少。我们知道缺血及活性氧物质 诱导的氧化应激反应会对缺血性心脏病患者心肌细 胞造成损伤,该研究为缺血性心脏病提出了一种新 的心肌保护基因疗法。血红素加氧酶一l(HO1及其产物一氧化碳、胆 绿素和铁均有明确的抗氧自

16、由基的作用。研究者发 现HO-1基因敲除小鼠心脏对IR损伤具有更高的 敏感性,因此提示了HO-l可能具有IR损伤心肌保 护作用ot3。Melo等刮用包含人HO-l基因的重组 腺相关病毒载体通过左室壁心外膜下注射导人心 肌,发现导人组可使急性I.R损伤后心肌梗死面积 减少75%以上,同时心肌脂质过氧化水平减低。又 有研究发现HO-l基因敲除小鼠遭受慢性低氧暴露 时心肌细胞凋亡会明显增加,提示HO.1可抑制心 肌纤维和细胞凋亡的发展5|。“u等刮研究发现 通过编码有人HO.1腺相关病毒导人心肌内,可以 抑制心肌梗死后心室重塑并改善心室功能。该研究 证明了通过载体导人方法过表达HO-1不仅可以有 效

17、抑制急性冠状动脉I-R损伤,减小心肌梗死面积, 而且对梗死后左室结构和功能具有长期的保护作 用。Pachori等【l”进一步研究发现,在SD大鼠心肌 过表达HO1对慢性反复性I-R损伤也有保护作用。 采用心外膜下注射法导人sD大鼠心肌,4周后用缝 线贯穿左前降支,线的两端穿过一个PE并留置在 皮下,这样反复造成冠状动脉缺血和再灌注。每天 15rain的冠状动脉缺血连续做5d,造成心肌慢性反 复性IR损伤。l周后超声心动图显示相对于HO.1导入组,对照组心室壁显著增厚,射血分数下降。细 胞凋亡与对照组相比可减少50%,并且降低活性氧 物质的产生。该研究为临床上遭遇多次I.R损伤患 者的治疗开辟了

18、新的前景。4.3抗凋亡策略IR损伤后线粒体受损,导致细胞色素C的释 放而引发细胞凋亡过程,Bel02蛋白家族可与促凋亡71因子Bax相互做用抵制细胞色素C释放达到阻止 凋亡的目的rl 81。已有研究发现在转基因小鼠中过 表达Bcl-2可显著减少急性I.R损伤后心肌细胞的 凋亡,减小心肌梗死面积。Bcl-xl是Bcl-2基因家族中另一成员,为了证明 腺病毒介导的Bclxl转染是否具有直接的I-R损伤 心肌保护作用,Huang等啪。通过编码Bclxl基因腺 病毒载体在I-R损伤48h前注射到心肌细胞,观察 到心肌凋亡显著抑制,心肌梗死面积显著减少,同时 血清心肌酶水平降低和心功能恢复加快。因此,

19、Bclxl可能为I-R损伤的心肌保护提供一种新的抗 凋亡疗法。肾上腺髓质素(AdrenomeduUin,AM是一种血 管活性多肽,具有多种生物学功能,如降低氧化应激 和抑制内皮细胞凋亡。Kato等【2首先研究了AM 在心肌IR损伤中的保护作用,他们利用腺病毒作 载体将AM基因导人大鼠心脏,发现AM可明显减 少I-R损伤后的梗死面积,抑制心肌细胞凋亡,减少 室性心律失常的发生。其研究结果表明AM可触发 Akt(又称蛋白激酶B磷酸化,导致促凋亡蛋白Bad 磷酸化增加,Bcl-2水平升高,进而抑制caspase-3活 性达到抗凋亡的目的。Yin等怛纠又用导管技术将 AM基因导入心肌进一步研究AM抗凋

20、亡机制,发 现AM可通过AktGSK-caspase信号通路抑制I.R 损伤诱导的心肌细胞凋亡。证实AM基因转导使 Akt和糖原合成激酶GSK-313磷酸化,降低GSK一313和半胱氨酸蛋白酶家族中的caspases一3活性而抑制 凋亡。该研究为AM的I-R损伤保护作用提出了新 的信号转导机制,并对以后缺血性心脏病分子治疗 靶点研究的发展具有重要意义。4.4多因素干预策略.据报道肝细胞生长因子(Hepatocyte growth fac tot,HGF在多种细胞尤其是上皮和内皮细胞中具 有多种生物功能,如促有丝分裂、促血管生成、抗凋 亡和抗纤维化等功能。Chen等旧1在缺血前将重组 的编码有H

21、GF基因的腺病毒载体导人兔心肌细胞, 使HGF在心肌内过表达,转导3d后夹闭冠状动脉 并做不同时间长短的再灌注,研究发现HGF转导可 抑制再灌注30rain后活性氧类物质的产生,尤其是 减少羟自由基的产生。经4h再灌注后HGF基因 导入组可显著加强抗凋亡因子Bcl-2在缺血区的表 达,可减少缺血再灌注后心肌细胞凋亡。同时还发 现,HGF基因转导可增加梗死区内新生毛细血管 数,显著减少梗死面积,增加心肌局部血供,改善心72功能。心肌缺血再灌注14d后观察发现心肌纤维 化面积与对照组相比显著减少。以上研究结果表明 在心肌缺血前转导HGF基因可起到抗自由基、抗凋 亡、抗心肌梗死、抗纤维化及心室重构等

22、多重心肌保 护作用。4.5导入保护性蛋白策略HSPs是生物体或离体培养细胞在应激状态下 产生的一类内源性保护蛋白。HSP70在正常细胞中 水平较低,应激状态下可显著升高,成为目前较为关 注的一个家族。HSPs在应激反应中发挥着“分子伴 侣”的功能,促进某些变性蛋白的降解和清除,维护 酶的动力学特征。HSP70通过增加Bcl-2的表达, 抑制Bax进入线粒体内,抑制细胞色素C从线粒体 内释放,或通过调节JNK、NFKB和Akt信号通路起 到抗细胞凋亡作用J。脑卒中实验动物模型研究 中发现HSP70的抗炎机制与其抑制核因子NFKB 的活性、减少炎症介质产生有关J。Jayakumar等m1利用日本血

23、凝病毒脂质体技术 将人的HSP70基因导入离体心脏,再异位移植入大 鼠腹腔内。发现导入HSPT0的心脏发生IR损伤后 线粒体功能及左室功能得到保护,其线粒体功能保 护的潜在机制可能是作为分子伴侣的HSP70保护 了线粒体呼吸链酶的活性,使呼吸控制指数在HSP 导入组显著高于非导人组。研究发现做过心脏手术 的患者,体内HSP70水平表达高的对I-R损伤的耐 受性增高。随着基因转染技术的提高,HSP70基因 治疗可成为供体心肌保护的临床可行方案。Belke等嵋刊观察了腺病素和腺相关病毒介导的 人诱导型HSP70过表达对心肌I.R损伤后收缩功能 的保护作用。研究结果发现,45d后腺病毒介导 组心肌内

24、诱导型HSP70表达量显著增高,IR损伤 后肌激酶释放减少,心肌收缩功能显著好于对照组。 还发现利用腺相关病毒做载体可长期表达诱导型 HSPTO,经过8个月的基因导人后仍有诱导型 HSP70表达,表明利用腺相关病毒表达诱导型 HSP70可长期保护I-R损伤后心肌功能。5结语发展和构建高效转移、具有组织特异性或靶向 性的基因表达载体是基因治疗未来的挑战。近年 来,人们利用巨噬细胞具有聚集于炎症的生物学特 性,开发了新的载体工程巨噬细胞载体。该载 体可经静脉输入体内,且可靶向炎症组织,并不断产 生携带的治疗性基因蛋白。有研究者利用转染了成 纤维细胞生长因子4(FGF4基因的巨噬细胞作为 载体,静脉

25、回输到心肌I.R损伤模型小鼠体内,转染 的工程巨噬细胞可靶向聚集在缺血区,促进缺血区 血管再生和增加局部血流。如何使目的基因在 体内高效稳定、可控性表达仍需要进一步研究。同 时心血管病基因治疗应用于临床仍有许多障碍,我 们仍需要大量临床实验以确定基因治疗的有效性及 安全性。 7参考文献:1Simkhovich BZ,MarjorJ刚rn P.Poizat C,et a1.Brief episode of ischemia activates protective genetic program in rat heart: A gene chip study.Cardiovase Res,200

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