三核苷酸重复序列PCR扩增中影子带的产生及其消除的方法

1、武辉张思仲肖翠英 【摘要】 目的 为了消除PCR扩增三核苷酸重复序列时产生的影子带。方法 以人 类强直性肌营养不良致病基因-肌张力蛋白激酶基因(myotonin protein kinase gene, MT-PK)3端非翻译区中的CTG重复序列为例，主要比较了PCR反应中单独使用Taq DNA聚 合酶和使用TaqPwo混合的DNA聚合酶对影子带产生的影响。结果 实验表明PCR反应中 单独使用Taq DNA聚合酶时，其PCR产物经PAGE电泳，银染显色后常有影子带形成，而向 Taq DNA聚合酶中加入具有3-5外切酶活性的Pwo DNA聚合酶则可完全消除影子带。 结论 本实验结果表明影子带产生

2、于PCR过程本身，而比Taq DNA聚合酶具有更高加工性 的组合酶则有可能消除或减弱影子带。 【关键词】 聚合酶链反应影子带三核苷酸重复序列 SHADOW BANDS IN PCR AMPLIFICATION OF TRINUCLEOTIDE REPEATS AND THEIR ELIMINATIONWu Hui, Zhang Sizhong*, Xiao Cuiying.*Department of Medical Genetics,West China University of Medical Sciences, Chengdu, 610041 【Abstract】 Objective

3、To explore a method for eliminating the shadow bands in PCR amplification of trinucleotide repeats.Methods CTG trinucleotide repeat sequence in the 3-untranslated region of the human myotonin protein kinase gene was used as templates DNA in PCR amplification, and the effectsof Taq DNA polymerase alo

4、ne and its mixture with Pwo DNA polymerase on occurrence of theshadow bands were compared. The PCR products containing (CTG)5, both from Taq DNA polymerase and from TaqPwo polymerase amplification, were cloned into pBluecript KS and sequenced on ALFexpressTM DNA sequencer respectively. Results The P

5、CR of DNA sequence containing CTG repeatsfrequently produced a main band (usually darker) and a shadow band (lighter) that differed from the main band by 3 base pairs when Taq DNA polymerase was used alone. However, when the mixture of TaqDNA polymerase and Pwo DNA polymerase was used, the shadow ba

6、nds usually disappeared. In the 4 clones containing PCR products amplified by Taq DNA polymerase, one clone contained only 4 CTGrepeats. However, this kind of decrease of repeat copy was not observed in the 5 clones containing PCRproducts amplified by using mixture of TaqPwo DNA polymerase. Conclusi

7、on The results of this experiment demonstrate that shadow bands occur during the PCR. Pwo DNA polymerase in known to possess not only DNA polymerase activity, but also 3-5 exonuclease activity, or proofreadingability. The mixture of Taq DNA polymerase and Pwo DNA polymerase has higher processivity t

8、hanTaq DNA polymerase itself. This may explain the effect on eliminating or reducing the occurrence of shadow bands in polymerase chain reaction. 【Key words】 Polymerase chain reactionShadow bandsTrinucleotide repeats DNA重复序列的检测在人类DNA多态研究和连锁分析中占有重要的位置。诸如三核 苷酸重复等大量微卫星DNA即可作为遗传标记使用，某些短重复序列的异常在遗传疾病 和肿瘤发

9、生中还具有病因学意义。因此短重复序列的PCR扩增和检测已成为许多实验室 的日常工作。然而，在重复序列的PCR扩增产物的电泳检测时，除主带外常可见一些显 色较浅的影子带1，后者常使等位片段的判读产生困难，从而影响对结果的正确分 析和临床诊断。如何消除这些影子带一直是许多研究者关注的问题，而迄今尚未见较 系统的研究和如何避免影子带产生的报道。有鉴于此，我们以人类强直性肌营养不良 致病基因-肌张力蛋白激酶基因(myotonin protein kinase gene,MT-PK)3端非翻译 区中的CTG重复序列为材料，重点考查了PCR扩增时不同聚合酶或酶的组合对影子带产 生的影响，并根据实验的结果就

10、影子带产生的机理进行了讨论。 1 材料与方法 1.1 实验材料 1.1.1 62例标本为本室采集的非相关正常人标本，年龄2054岁。图1标本系其中的4 个样品，且每组比较的结果均分别来自对同一个体的同批DNA标本PCR扩增的结果。 1.1.2 寡核苷酸引物 参照Mahadevan等2合成。其序列为：正向引物： 5-GCTCGAAGGGTCCTTGTAGCC-3；反向引物：5-GGGGGTGCGTGGAGGATGGAA-3。引物 分别位于19q13.3上的MT-PK基因3非编码区中的CTG重复序列两侧，该重复区在正常群 体中呈高度多态24。 1.1.3 外周血DNA按常规方法制备5。 1.1.4

11、 耐热DNA聚合酶 Taq和Pwo DNA聚合酶分别购自BRL和Boehringer Mannhein公司。 1.2 实验方法 1.2.1 PCR扩增 PCR扩增按常规方法。在PE-9600型扩增仪上进行。反应体积为50l， 内含10mmolL Tris-Cl(pH8.8)，25mmolL KCl，5mmolL(NH4)2SO4，1.5mmolL MgCl2，200molL dNTP，300nmolL引物，50ng模板DNA，Taq DNA聚合酶或TaqPwo 混合酶(51) 1.5U。在95预变性8分钟，进入循环。循环条件为：94 30秒，60 30秒， 72 20秒，共30个周期。最后在7

12、2延伸7分钟。每批反应均设置阴性对照，即反应 系统中以等体积灭菌超纯水代替模板DNA。 1.2.2 PCR产物的电泳检测 电泳用BRL公司的丙烯酰胺凝胶按丙烯酰胺甲叉丙烯酰胺 191的比例制成8%的非变性胶板，PCR产物中加入16体积的上样缓冲液后，每次取等 量产物液(25l)，点样于相应的上样孔。电泳在V16电泳仪(BRL)上进行，在300V， 1520mA条件下，电泳3.5小时后，用银染法6，即先将凝胶在10%乙醇中浸泡5分钟 后，用1%硝酸处理5分钟，双蒸水冲洗后，浸于0.2%硝酸银中20分钟，用纯水冲洗3次， 最后用3%碳酸钠(含0.019%甲醛)显影，至各带清晰可见后，用5%醋酸停显

13、并照相记录。 1.2.3 应用两种DNA聚合酶的PCR产物的序列分析 用于测序的PCR产物通过下列反应制 备，PCR反应总体积为100l，内含100ng DNA模板，3U Taq DNA聚合酶或3U TaqPwo DNA聚合酶(51)，其余条件如前1.2.1所述。PCR产物的回收及纯化采用Qiagen公司的 PCR产物纯化试剂盒，按使用说明书进行。纯化的PCR产物按本室新进发展的同端化PCR (UT-PCR)的方法7进行扩增。扩增产物经BamHI酶切后，按Sambrook等5的方法克 隆至pBluescript KSBamHI质粒中，然后转化到大肠杆菌JM107，挑取白色菌落进行 培养扩增、酶

14、切鉴定。阳性克隆再经培养扩增，用碱裂解法提取质粒DNA。重组质粒DNA 的双链测序用Pharmacia公司的Cy5 AutoReadTM测序试剂盒，按说明书建议的方法略加改 进后，在ALFexpressTMDNA测序仪上进行。 1.2.4 特异性PCR产物的确定 各条电泳带均依照主带的位置，参照分子量大小标记 (pBR322Hea，外添158bp的PCR产物)确定。随机挑选部分按电泳确定了片段大小的PCR 产物标本进行测序，结果其PCR产物的特异性及片段大小与测序结果完全一致。 2 结果 2.1 PCR产物电泳后的银染结果 62例正常个体的MT-PK基因3非编码区的CTG三核苷酸 重复序列的P

15、CR扩增结果表明：单独使用Taq DNA聚合酶时，在绝大多数情况(2022)在 主带下方出现了影子带，后者与主带的位置相差3bp(参照分子量大小标记)。而采用 TaqPwo DNA聚合酶(51)则未见影子带的产生(4040)。应用Taq DNA聚合酶和 TaqPwo DNA聚合酶的结果比较见图1。图1中、为杂合子(5和15拷贝CTG的等位片 段)，、为纯合子(分别为13和5拷贝CTG的等位片段)，其中2、2、2、2在 主带下均可见有一条影子带，而1、1、1、1在主带附近均无影子带。图2显示 其中10个样本用TaqPwo DNA聚合酶的扩增结果。 2.2 比较两种DNA聚合酶的PCR产物的序列分

16、析结果 对上述 DNA样品分别使用了Taq DNA聚合酶和上述的混合酶，采用1.2.3中所述方法对二者的PCR产物分别进行测序。结 果在使用Taq DNA聚合酶的PCR产物重组质粒的5个阳性克隆中发现了1个CTG为4拷贝的 克隆(15)。而使用上述混合酶扩增后，选出的6个阳性克隆中，CTG拷贝数全为5(图 3)。由于采用了相同的DNA模板，这一结果支持影子带产生于PCR反应过程中，而似与 模板的异质性，即有无突变细胞关系不大。 3 讨论 影子带的存在一直是困扰分子生物学实验工作者的问题，如何消除影子带，迄今 仍未见有满意的方法报道。一般认为采用加有甲酰胺或尿素的聚丙烯酰胺凝胶电泳可 减少其出现

17、8。此外我们过去也曾通过银染 图1 (左)4个不同个体CTG区域分别用Taq和TaqPwo DNA聚合酶PCR扩增的电泳银染结 果 Taq DNA聚合酶扩增的样本：2、2、2、2，在主带下可见一条影子带。1、 1、1、1为TaqPwo DNA聚合酶PCR扩增的结果，1和2、1和2、1和2、 1和2分别为同一个体的同批DNA样本，M为pBR322Hae158bp的PCR产物 图2 (右)用TaqPwo DNA聚合酶扩增11个不同个体样本的结果，除主带外，均见不到 影子带，M为pBR322Hae158bp的PCR产物 Fig 1 (left) The PCR of 4 DNA samples co

18、ntaining CTG region by using Taq and TaqPwo DNA polymeraserespectively The silver stain detection after PAGE electrophoresis indicates that by using Taq DNA polymerase,the samples2,2,2 and 2 show shadow bands(lighter) below a mainb and, however,by using TaqPwoDNA polymerase 1,1,1,1 do not show the s

19、hadowbands. M denotes pBR322Hae158bp PCRproduct. Fig 2 (right) The PCR analysis of 11 individuals DNA samples by using the mixture of TaqPwoDNA polymerase It only shows the specific main bands detected by silver stain after PAGE electrophoresis. M denotes pBR322Hae 158bp PCR product 图3 3a、3b为采用TaqPw

20、o DNA聚合酶扩增后，其产物克隆至载体，其中的两上阳性 克隆所测CTG重复序列及其两侧部分序列的结果，3c为单独使用Taq DNA聚合酶扩增后， 在5个阳性克隆中所发现的一个CTG拷贝数为4的测序结果 Fig 3 The sequencing analysis of PCR products containing 5 CTG repeats. 3a and 3b indicate CTG region, whichcome from 2 clone in 6 clones that contain the PCR products by using TaqPwo DNA polymerase

21、. 3c indicatesthat one 4 copies which comes from one clone in 5 clones that contain the PCR products by using Taq DNA polymerase. 显影时间和控制PCR的DNA模板量及延伸时间，来控制影子带的出现9，但效果仍不 很理想。我们的实验结果表明：在PCR扩增三核苷酸重复序列中，单独使用无3-5 外切核酸酶活性的Taq DNA聚合酶常有影子带形成，实验同时也证实了影子带是PCR过 程中产生的。Pwo DNA聚合酶具有35的外切核酸酶活性，即具有“校读”的功 能。当将这两种酶以

22、一定比例混合使用时，可以提高PCR的扩增效率(本文未示实验结 果)。类似DNA聚合酶的组合在进行长的和精确的PCR(long and accurancy PCR)中被采 用10，但未见将此种组合酶用于消除影子带研究的报道。本实验中我们发现：使用 这种混合酶，即使用高灵敏度的银染显示方法在主带附近也未出现影子带。 关于影子带成形机理，Muray等在研究CA二核苷酸重复序列的PCR扩增时认为，CA 重复序列区中2bp的随机缺失所导致的影子带可能是DNA链在复制过程中的滑动(slippage) 所致，并曾设想一种高效(high processity)的DNA聚合酶可以降低影子带的产生1。 Hauge

23、等也认为PCR过程中“滑动链的错配”(slipped strand mispairing)是影子带产 生的主要机制11。我们采用了两种不同DNA聚合酶体外扩增正常人模板DNA，我们报 告的结果也表明影子带的出现是由于PCR扩增的结果，同时排除了我们曾经推测影子带 是由于体细胞变异所致。由此推测在PCR扩增三核苷酸重复序列区时所见的影子带也是 DNA链滑动的结果，即与PCR扩增二核苷酸重复序列区时相似。而在PCR扩增中使用Taq DNA 聚合酶与上述具有“校读”功能的聚合酶的混合物可以避免PCR扩增三核苷酸重复序列 区时影子带的产生。一般说来，PCR扩增二核苷酸重复序列区时更易产生影子带，上述

24、方法能否消除其影子带还须进一步验证。除使用上述的组合酶及PCR缓冲液外，如同时 考虑使用较低的循环周期数及引物的重设计因素，至少能在一定程度上控制PCR扩增二 核苷酸重复序列区影子带的产生。 本课题受国家自然科学基金(39570388)及卫生部科学基金资助 作者单位：610041 成都，华西医科大学附属第一医院医学遗传研究室 参 考 文 献 1 Murray V, Chutima M, England PR. The determination of the sequences present in the shadow bandsof a dinucleotide repeat PCR. N

25、ucleic Acids Res, 1993,21(10)2395-2398. 2 Mahadevan M, Amemmiya C, Jansen G, et al. Myotonic dystrophy mutation: An unstable CTG repeatin the 3untranslated region of the gene. Science, 1992,255(5049)1253-1255. 3 Brook JD,Mc Currach ME, Harley HG. Molecuar basis of myotonic dystrophy: Expansion of atrinucleotide(CTG) repeat at the 3end ofa trancript encoding a protein kinase family member. Cell,1992,68(4)799-808. 4 Mahadevan M, Amemmiya C, Jansen G, et al. Strcture and genomic sequence of the myoto dystrophy(DM kinase) gene. Hum Mol Genet,1993,2(3)299-304. 5 Sambrook J, Fritsch EF, Mani