PCR检测时对实验室DNA污染的清除

1、紫外线照射清除HBVDNA作用研究刘军权 【摘要】 目的 观察紫外线对PCR外源性HBVDNA污染的作用。方法 用紫外线对不同浓度的HBVDNA阳性血清标本和HBV阳性参控品进行固相和液相状态紫外线照射。结果 三种干燥后的标本随着紫外线照射时间的延长，HBVDNA清除率明显增加。HBV阳性参控品与相同HBVDNA拷贝数的血清标本置紫外线照射后，每相同的照射时间HBVDNA下降率前者均显著高于后者。血清标本和HBV阳性参控品经11万倍稀释、紫外线照射2小时后，前者HBVDNA下降33.3倍，后者下降6250倍。结论 紫外线消毒法对阳性血清标本造成的实验室污染不能清除；阳性模板经紫外线消照射后HB

2、VDNA含量明显降低；紫外线照射对清除物体表面较低含量阳性HBVDNA模板或HBVDNA引起的气溶胶可能有效。【要害词】 紫外线 消毒 聚合酶链反应 乙型肝炎病毒Study on Cleared effect of Ultraviolet radiation in induced contamination of HBVDNALIU Junquan , ZHOU Zhonghai, YAN Weimin. Department of Central Laboratory, 97th hospital of PLA, Xuzhou 221004, P. R China【Abstract】Obje

3、ctive To observe the effects of Ultraviolet radiation on contamination of external HBVDNA. Methods HBVDNA positive serum samples and HBV positive control serum samples with different concentration were disinfected by Ultraviolet radiation in solid state and liquid state. Result The cleared rate of H

4、BVDNA in three kinds of dry samples increased markedly along with prolonged disinfectant time of Ultraviolet radiation. After HBV positive control samples and serum samples with same copies have been irradiated by Ultraviolet radiation, it showed that the cleared rate of HBVDNA of the former was rem

5、arkably higher than that of the latter. HBVDNA of serum samples reduced 33.3-fold and that of HBV positive control samples reduced 6250-fold after they were diluted to 1:10000 and disinfected 2 hours by Ultraviolet radiation. Conclusion The positive serum samples induced contamination in laboratory

6、could not been cleared away by Ultraviolet radiation; Been disinfected, the concentration of HBVDNA of positive serum samples reduced obviously; Ultraviolet radiation may have effects in clearing away the low concentration of HBVDNA of positive serum samples or aerosol induced by DNA on surface of o

7、bjects.【Key words】Ultraviolet radiation; disinfect; Polymerase chain reaction; Hepatitis B virus紫外线照射是聚合酶链反应（PCR）测定的实验室常用消毒方法，对控制外源性DNA污染引起的假阳性较其他消毒方法更为有效。但是紫外线照射对不同的污染环境和污染物的消毒效果报导不一1-3。为了观察紫外线对HBVDNA消除情况，我们用紫外线对不同浓度的HBVDNA阳性血清标本和HBV阳性参控品进行固相和液相状态紫外线照射比较，现将结果报告如下。1 材料和方法1.1 材料 Roche lightcycler 荧光P

8、CR检测仪（德国罗氏公司产品）；乙肝病毒核酸扩增PCR荧光检测试剂盒（深圳匹基生物工程股份有限公司产品）；石英紫外线杀菌灯(30W，1米处辐射强度为105Wcm2由江苏省启东市荧光厂生产)。1.2 方法1.2.1 污染标本的制作 将高浓度（5107/ml copies）与低浓度（5103/ml copies）HBVDNA阳性血清标本和HBV阳性参控品（5107/ml copies）按1111万倍比例稀释加入96孔细胞培养板中，每孔0.1ml。将检测标本分为2组；A组：置4冰箱自然干燥后用紫外线消毒；B组：直接置紫外线灯下照射。1.2.2 紫外线照射时间的选择 将A和B组标本分别置于紫外线灯下照

9、射30、60、120分钟后A组标本用亚沸蒸馏水恢复原体积，收集于0.5ml尖低离心管中备用；B组吸取标本，置于0.5ml尖低离心管中备用。1.2.3 乙肝病毒核酸扩增PCR荧光检测 按试剂盒说明书要求进行 血清标本先进行DNA提取，然后加入核酸扩增试剂（含PCR反应液、Taq酶和UNG酶）中，HBV阳性参控品直接加入核酸扩增试剂内，用Roche lightcycler 荧光PCR检测仪实时监控检测HBVDNA copiesml。2 结果2.1 A组经紫外线照射后HBVDNA含量变化见表1 三种干燥后的标本随着紫外线照射时间的延长，HBVDNA的清除率明显增加。HBV阳性参控品与相同HBVDNA

10、拷贝数的血清标本置紫外线照射后，每相同的照射时间HBVDNA下降率前者均显著高于后者。血清标本经紫外线照射2小时后HBVDNA 11100倍稀释的标本下降15.6倍，11001万倍稀释下降5.633.3倍；而HBV阳性参控品经11100倍稀释下降17.9108.7倍，1001万倍稀释下降108.76250倍。表1 A组经紫外线消毒后HBVDNA含量变化浓度 血清标本（5103/ml copies） 血清标本（5107/ml copies） HBV阳性参控品（5107/ml copies）（稀释倍数） 照射时间（分钟） 照射时间（分钟） 照射时间（分钟）30 60 120 30 60 120 3

11、0 60 1201：1 4.6103 4.9103 5.3103 5.4107 4.9107 4.7107 2.5107 1.1107 2.81061：10 4.5102 4.0102 1.5102 3.1106 2.0106 3.0106 1.2106 9.5105 7.31041：100 4.010 3.510 110 2.1105 1.3105 7.7104 1.3105 3.4104 4.61021：1000 4.5 4.0 3 4.0104 3.5104 9.4103 1.5104 1.9103 8.01：10000 0 0 0 3.5103 8.5102 1.1102 1.7103

12、 4.1102 01：100000 0 0 0 2.0102 1102 1.510 9.010 1.010 02.2 B组经紫外线照射后HBVDNA 三种标本在液相状态下，紫外线照射对HBVDNA降解作用较低，但HBV阳性参控品下降率仍显著高于血清标本，含量变化见表2。表2 B组经紫外线消毒后HBVDNA含量变化浓度 血清标本（5103/ml copies） 血清标本（5107/ml copies） HBV阳性参控品（5107/ml copies）（稀释倍数） 照射时间（分钟） 照射时间（分钟） 照射时间（分钟）30 60 120 30 60 120 30 60 1201：1 6.1103 5

13、.1103 5.5103 4.3107 4.7107 4.3107 3.3107 5.0107 2.11061：10 4.3102 3.0102 3.6102 4.5106 5.6106 5.1106 4.5106 1.1106 1.91051：100 2.810 2.210 1.510 4.9105 5.1105 3.7105 2.1105 7.7104 1.11041：1000 6.0 4.0 0 5.6104 4.4104 2.5104 2.2104 9.7103 1.81031：10000 0 0 0 3.8103 2.1103 1.3103 9.5102 1.6102 7.9101：

14、100000 0 0 0 3.510 2.410 1.110 3.010 1.510 7.03 讨论PCR测定出现假阳性结果通常是由外源性DNA污染所致，病人标本中的病毒颗粒、阳性对照均是造成实验室严重污染的主要因素。紫外线可以降解DNA或使DNA发生突变、失活和破坏DNA结构、阻断DNA的复制。所以经紫外线照射后DNA难以扩增。紫外线照射方便易行，消毒面广，对室内仪器设备影响较小。因此被广泛应用于各实验室消毒。但是紫外线消毒效果受灯管的辐射强度、照射时间、微生物的种类、有机物的含量、温度和湿度的影响1,4。为了解紫外线消毒状况和有效范围，选择正确的消毒方法和时间，以减少实验室PCR检测外源性

15、DNA污染，我们将HBVDNA阳性标本进行了相关试验。结果显示，HBVDNA阳性血清标本和HBV阳性参控品经低温干燥后，用紫外线照射2小时，HBVDNA高拷贝数的血清标本下降比例高于低拷贝数的血清标本，同样拷贝数的HBV阳性参控品显著高于血清标本；各种标本随着稀释倍数的增加，经紫外线照射后HBVDNA的下降比例明显增加，说明标本中有机物如蛋白质等含量的高低直接影响到紫外线的照射效果。HBVDNA阳性血清标本和HBV阳性参控品在液相状态，经紫外线照射2小时后HBVDNA下降比例不明显。这一结果表明，紫外线对HBVDNA阳性的液态标本照射无实际价值。以上实验结果表明，紫外线对阳性血清标本造成的实验

16、室污染不能清除；阳性模板经紫外线消照射后可以降低其含量，对清除物体表面较低含量阳性DNA模板或DNA引起的气溶胶可能有效。因此，在进行PCR实验室操作时，必须严格按PCR实验操作规程试验，在操作中应尽量减少各种标本外溢和溅出，以免引起实验室污染，每次实验完毕需认真清洗实验操作台和实验室环境。在进行下一次实验前，实验环境应用紫外线照射2小时以上。一旦造成实验室DNA污染，将直接或可能是不可逆转地影响今后的实验室试验结果。参考文献1 刘怀田，李荣芬。紫外线表面消毒应用研究的进展。中国消毒学杂志，1994；11（1）：37-382 王占科，祝仲珍。紫外线照射消除PCR技术外源性DNA污染。人民军医，

17、1997；5：2862973 宋维汉，苏学今，张新秀，等。三种物理方法对乙型肝炎病毒消毒效果的观察。白求恩医科大学学报，1998；1：1051074 居喜娟，薛广波，卞雪莲，等。紫外线空气消毒器除菌效果的研究。中国消毒学杂志,1994；11（4）：233-236 防止PCR外源性HBV-DNA污染的实验研究 摘要 目的 选择一种消除实验室DNA污染的最佳消毒方法。方法 用压力蒸汽消毒、紫外线消毒、84消毒液、过氧乙酸消毒液、次氯酸钠溶液和2戊二醛消毒液，按常规方法对高浓度（5107copies/ml ）与低浓度（5103copies/ml ）HBVDNA阳性血清标本和HBV阳性参控品进行消毒处

18、理，然后用PCR检测技术检测HBVDNA浓度的变化。结果 HBVDNA阳性血清标本经84消毒液消毒后不能检出HBVDNA；过氧乙酸、次氯酸钠和戊二醛消毒液及紫外线照射消毒法消毒后HBVDNA含量减少；压力蒸汽消毒法对血清标本中的HBVDNA无作用。结论 84消毒液能完全清除阳性血清标本中的HBV-DNA；高压蒸汽、过氧乙酸、次氯酸钠和2戊二醛及紫外线照射消毒法不能完全清除阳性血清标本中的HBVDNA。要害词：乙型肝炎病毒；消毒；方法；聚合酶链反应中图分类号： 文献标识码： 文章编号：The Study on the Prevention of External HBV-DNA Contamin

19、ationLIU Jun-quan, CHENG Fu-xing, ZHOU Zhong-hai, ZHANG Yu-xi( Department of Central Laboratory, 97 th hospital of PLA, Xuzhou 221004, Jiangsu Province, China)Abstract: OBJECTIVE To select an optima antisepis to avoid DNA contamination during polymerase chain reaction experiments. METHODS Hepatitis

20、virus B(HBV)DNA from serum samples and control samples were antisepsised by six methods, including pressche steam; ultraviolet radiation,84-disinfector, peroxide acetic acid, hypochlirite mareium and 2% glutara ldehyde disinfector. RESULTS HBV-DNA couldnt be detected after being dealed with 84-disin

21、fector, while pressure steam antisipsis had no effects on decreasing DNA contamination. Other four methods had lower efficiency. CONCLUSIONS 84-disinfector is able to clear all the HBV-DNA of positive serum samples, while other five methods are not able to.Key words: Hepatitis B virus; disinfect; me

22、thods; Polymerase chain reaction检测乙肝病毒（HBV-DNA）在我国常被用来间接评价消毒剂杀病毒的效果。用聚合酶链反应（PCR）检测HBV-DNA具有操作简便、灵敏度高和特异性强等优点。但也常因微量污染而产生假阳性结果。近年来，人们采用了许多方法消毒处理不同的污染环境和污染物1-4，但消毒效果报导不一。为选择一种消除实验室DNA污染的最佳消毒方法，我们选用六种传统的消毒法进行对比研究。现将结果报告如下。1 材料和方法1.1 材料Roche lightcycler 荧光PCR检测仪（德国罗氏公司产品）；乙肝病毒核酸扩增PCR荧光检测试剂盒（深圳匹基生物工程股份有限

23、公司产品）；石英紫外线杀菌灯(30W，1米处辐射强度为105Wcm2由江苏省启东市荧光厂生产)；XMG12脉动真空蒸汽灭菌器（连云港千婴医疗设备有限公司）；84消毒液（南京江南消毒剂厂产品）；过氧乙酸（江苏双氧水厂产品）；戊二醛消毒剂（Merck产品）；次氯酸钠（上海试剂一厂综合经营公司产品）；甘氨酸和硫代硫酸钠（中国医药上海化学试剂公司）。1.2 方法1.2.1 乙肝病毒核酸扩增PCR荧光检测 按试剂盒说明书要求进行 取标本0.1ml先进行DNA提取，然后加入核酸扩增试剂（含PCR反应液、Taq酶和UNG酶）中，HBV阳性参控品直接加入核酸扩增试剂内，用Roche lightcycler 荧

24、光PCR检测仪实时监控检测HBVDNA。1.2.2 中和剂的选择 84消毒液、过氧乙酸和次氯酸钠用2.0%硫代硫酸钠；戊二醛用1甘氨酸。1.2.3 紫外线消毒法 将高浓度（5107copies/ml ）与低浓度（5103copies/ml ）HBVDNA阳性血清标本和HBV阳性参控品（5107copies/ml ）按1111万倍比例稀释加入96孔细胞培养板中，每孔0.1ml；置4冰箱自然干燥后，将标本分别置于紫外线灯下照射30、60、120分钟；用亚沸蒸馏水恢复原体积，收集于0.5ml尖低离心管中及时进行PCR测定。1.2.4 压力蒸汽消毒法 将浓度为5107copies/ml 的阳性血清标本

25、置试管中，放入高压灭菌器内进行123,20min和135,10min加热消毒后及时进行PCR测定。1.2.5 四种化学消毒剂对标本的消毒处理 吸取浓度为5107copies/ml 的阳性血清标本20微升，分别加入经120稀释的84消毒液、1：100稀释过氧乙酸消毒液、含氯量为2000mg/L的次氯酸钠溶液和2戊二醛消毒液各80微升于塑料尖底离心管中；在20环境下，标本在84和过氧乙酸消毒液中作用2h，戊二醛和次氯酸钠消毒剂中作用30min，立即加入相应的中和剂中和，然后及时进行PCR测定。1.2.6 对照试验 PCR扩增产物经4种化学消毒剂作用相应时间和加入中和剂后，再分别每管加入阳性血清标本

26、（5107copies/ml) 20微升，混匀后及时进行PCR测定。2 结 果2.1 经紫外线照射后HBV-DNA含量见表1 三种标本随着紫外线照射时间的延长，HBV-DNA的清除率明显增加。HBV阳性参控品与相同HBV-DNA拷贝数的血清标本置紫外线照射后，每相同的照射时间HBV-DNA下降率前者均显著高于后者。血清标本经紫外线照射2小时后，11100倍稀释的标本，HBV-DNA下降15.6倍；11001万倍稀释，HBV-DNA下降5.633.3倍；而HBV阳性参控品经11100倍稀释时，下降17.9108.7倍，11001万倍稀释下降108.76250倍。表1 经紫外线消毒后HBV-DNA

27、含量变化浓度 血清标本（5103copies/ml ） 血清标本（5107copies/ml ） HBV阳性参控品（5107copies/ml）（稀释倍数） 照射时间（分钟） 照射时间（分钟） 照射时间（分钟）30 60 120 30* 60* 120* 30 60 1201：1 4.6103 4.9103 5.3103 5.4107 4.9107 4.7107* 2.5107 1.1107 2.81061：10 4.5102 4.0102 1.5102 3.1106 2.0106 3.0106* 1.2106 9.5105 7.31041：100 4.010 3.510 110 2.1105

28、 1.3105 7.7104* 1.3105 3.4104 4.61021：1000 4.5 4.0 3 4.0104 3.5104 9.4103* 1.5104 1.9103 8.01：10000 0 0 0 3.5103 8.5102 1.1102* 1.7103 4.1102 01：100000 0 0 0 2.0102 1102 1.510* 9.010 1.010 0注：*与相应照射时间的HBV阳性参控品结果比较， p0.05；* 与相同稀释倍数的HBV阳性参控品结果比较，p0.01.2.2 五种消毒法对HBVDNA阳性血清标本的影响标本经不同消毒方法处理后，84消毒液能完全清除HB

29、VDNA阳性血清标本中的病毒颗粒，使HBVDNA不能检出；过氧乙酸消毒液、次氯酸钠消毒液和戊二醛消毒液及紫外线照射消毒可以减低DNA含量；压力蒸汽消毒法对HBVDNA无作用，结果见表2。表2 HBVDNA阳性血清标消毒前后DNA含量变化 (copies/ml)消毒方法 消毒前 消毒后 对照试验 HBV-DNA减少倍数压力蒸汽消毒 123、20min 5107 3.3107 1.5压力蒸汽消毒 135、10min 5107 9.1107 1.884消毒液 5106 0 3.1106 5106过氧乙酸消毒液 5106 7.3105 2.7106 6.8戊二醛消毒液 5106 2.5106 2.5105 2.0次氯酸钠消毒液 5106 1.710