免疫组化地原理和步骤

1、免疫组织化学的概念： 免疫组化是利用抗原与特异性结合的原理，通过化学反应使标记的显色剂 （ 荧光素、酶、 金属离子、同位素 ） 显色来确定组织细胞抗原 （多肽和蛋白质 ） ，对其进行定位、定性及定 量的研究，称为免疫组织化学。免疫组化实验所用的有哪些？ 免疫组化实验中常用的抗体为单抗体和多抗体。 单抗体是一个 B 淋巴细胞分泌的抗体， 应 用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备。多克隆抗体是将纯化后的抗原直接免疫动物后，从 动物血中所获得的免疫血清，是多个 B 淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。 免疫组化实验所用的组织和细胞标本有哪些？ 实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类，前者包括石蜡切片（病理大

2、片和组织芯片） 和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续 切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究；石蜡切片制作过程对组 织抗原暴露有一定的影响，但可进行抗原修复，是免疫组化中首选的组织标本制作方法。 石蜡切片为什么要做抗原修复？有哪些方法？石蜡切片标本均用甲醛固定， 使得细胞抗原形成醛键、 羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇， 同时蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。所以要求在进行 IHC 染色时，需要先进行 抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。 常用

3、的抗原修复方法有微波修复法，高压加热法，酶消化法，水煮加热法等，常用的修复 液是 pH6.0 的 0.01 mol/L 的柠檬酸盐缓冲液。免疫组化常用的染色方法有哪些？ 根据标记物的不同分为免疫荧光法，免疫酶标法，亲和组织化学法，后者是以一种物质对 某种组织成分具有高度亲合力为基础的检测方法。这种方法敏感性更高，有利于微量抗原 （抗体 ）在细胞或亚细胞水平的定位，其中生物素 抗生物素染色法最常用。抗体交叉反应的原因： 指抗体除与其相应的抗原发生特异性反应外还与其它抗原发生反应。 产生的原因有以下几 个方面：1. 抗原特异性指用于免疫动物的抗原性物质中含有多种抗原分子，它引起动物产生针对 多种抗

4、原分子特异性的相应抗体。 任何其它物质只要含有一种或多种与上述物质相同的抗 原分子，必将与上述多特异性的抗血清发生交叉反应。2. 共同决定簇即两种抗原分子中都含有相同的抗原决定簇。3. 决定簇相似，两种不同的抗原决定簇，如果结构大致相同，由于空间构象关系，某一 决定簇的相应抗体可以与大致相同的决定簇发生交叉反应。 当然抗原一抗体之间构象相似 时的结合力小于吻合时的结合力。免疫细胞化学技术 一、免疫细胞化学技术的概述* 免疫细胞化学 （immunocytochemistry, ICC）- 是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素 ） 显色来确

5、定细胞抗原的成分 （主要是多肽和蛋白质 ） ，对其进行定位、 定性及定量的研究，称为。( 一 ) 对抗原和抗体的要求* 具有特异性高和亲和力强的抗体是实验成功的首要条件。- 对抗体的要求：纯度高、比活性强；* 高度特异性抗体的获得，取决于抗原的纯度。-对抗原的要求：纯度高，免疫原性强，稳定无变化。( 二 ) 抗原 (antigen, Ag)* 抗原的概念：凡是在机体引起体液免疫和( 或) 细胞免疫反应的物质，称为抗原。抗原具有两个方面的特性：- 免疫原性：引起机体产生抗体和(或) 致敏淋细胞的特性；- 免疫反应性：抗原能与相应的抗体及致敏淋巴细胞发生特异的结合或反应的特性。* 根据抗原是否显示

6、免疫原性分为：- 完全抗原 ：分子量较大，一般在 10kDa 以上，并具有较复杂的化学组成。* 免疫原性最强的是蛋白质抗原，多糖次之；脂类和核酸必需和蛋白质及多糖形成复合物 才具有良好的免疫原性。- 半抗原 ：又称为不完全抗原，分子量较小。例如：某些短肽、多糖、类脂和药物等。* 半抗原必需与载体结合，才能获得免疫原性。载 体 ：通常是具有高度免疫原性的大分子物质，具有将免疫原性传递给耦联的半抗原能 力。- 常用的载体有钥孔血蓝蛋白 (keyhole limpet hemocyanin， KLH) 、牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA) 、卵白蛋白 (Ovalbum

7、in ， OVA) 等。- 用戊二醛或碳化二亚胺作为交联剂通过功能基团 -NH2 、-COOH 等将半抗原结合到载体 上。结合比例为5kDa结合525个分子的小肽。(三)抗体 (antibody, Ab)1 、抗体的概念：* 机体受到抗原刺激后， 由浆细胞合成并分泌出一类具有与抗原发生特异性结合的球蛋白， 被称为抗体。- 抗体主要存在于血清； -抗体都是免疫球蛋白，但免疫球蛋白并不一定都是抗体。- 免疫球蛋白根据重链的结构及抗原特异性不同分为五种，既IgG 、 IgD 、IgE 、 IgA 、IgM 。2 、免疫组化实验中常用的抗体：单克隆抗体和多克隆抗体。* 单克隆抗体：是一个 B 淋巴细胞

8、克隆分泌的抗体，是应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物 制备的。-特异性强、抗体产量高。* 多克隆抗体：是将纯化后的抗原直接免疫动物后，从动物血中所获得的免疫血清，是多 个 B 淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。- 特异性低，会产生抗体的交叉反应。-多克隆抗体广泛应用于石蜡包埋组织切片，可减少假阴性染色机会。- 抗原与抗体的结合，要求量保持一定比例，当抗原或抗体过量时，是不能聚合成大颗粒。3 、抗体的制备 多克隆抗体的制备* 动物的选择* 佐剂 (adjuvant)* 免疫方法* 免疫剂量* 抗体效价的测定* 放血或定期抽血(1) 动物的选择 选择什么动物来免疫取决于：* 所需抗血清的量-小鼠只能提供

9、1.01.5ml的血液，而山羊能提供几升。* 能供免疫用的抗原量-小鼠 50 g 足够，而山羊需要几毫克。(1) 动物的选择 (续)* 动物的品系：免疫动物与提供抗原的动物之间的种系差异越大越好。- 例如哺乳动物的抗原可选择非哺乳动物来制备抗体。- 常用的动物有兔、羊、马、猪等，以兔(新西兰兔，年轻，健壮，体重在2.5kg 左右，雄性)为最常用。(2) 佐剂 (adjuvant)* 一般可溶性抗原注射后，迅速从注射部位扩散、吸收代。佐剂可延长潴留时间，且延长 免疫刺激作用。因此在制备抗体的过程中，常将抗原和佐剂一起注射。* 最常用的佐剂是弗氏佐剂，又分为 :- 弗氏不完全佐剂 (Freund&

10、#39;s incomplete adjuvant)- 弗氏完全佐剂 (Freund's complete adjuvant)弗氏不完全佐剂(Freund's incomplete adjuvant, FIA)* 是由油剂 ( 石蜡油或植物油 ) 与乳化剂 ( 羊毛脂或 Tween80) 混合而成， 比例为 1:1 、2:1 、 3:1 或 5:1 ，可根据需要而定，通常 2:1 。* 使用时与水溶性抗原按 1:1 比例充分混合，使抗原分散在佐剂中形成油包水乳剂。 弗氏完全佐剂 (Freund's complete adjuvant, FCA)* 在弗氏不完全佐剂中加入

11、活卡介苗或死的结核分枝杆菌 ( 终浓度为 2 20mg/ml) ，即成 为 FCA 。* 免疫动物时，将弗氏佐剂与抗原按体积 1:1 混合乳化后 ( 油包水 ) 注入动物。- 一般首次注射时用完全佐剂乳化，第二次或第三次注射时用不完全佐剂或不用佐剂。 佐剂与抗原乳化的方法* 研磨法：适于制备大量的佐剂抗原- 先将不完全佐剂加热，取 1.73ml 放人无菌玻璃研钵；缓缓滴入 0.23ml 活卡介苗，边 滴边按同一方向研磨，使菌体完全分散。- 按同样方法滴人抗原，每加一滴应研磨至小滴消失。滴加抗原的速度要慢，待抗原全部 加人后，应成为乳白色粘稠的油包水乳剂。* 缺点：研钵壁上粘附大量乳剂，抗原损失

12、较大，对微量或难得抗原不宜采用。佐剂与抗原乳化的方法 （ 续）* 注射器混合法- 将等量的完全佐剂和抗原分别吸人两个 5ml 注射器，然后插入三通管，交替推动针管混 匀，往复操作直至形成粘稠的乳剂为止。* 优点：无菌操作，节省抗原或佐剂。* 缺点：不易乳化，时间长。 佐剂与抗原乳化的方法 （ 续）* 快速乳化法：利用超声波粉碎器可快速乳化抗原和佐剂混合物。- 将抗原和佐剂按所需量加入一中，置于超声波粉碎器上，粉碎头浸入液面下 0.5cm ，离 瓶底 0.5cm 左右，以免打碎。-每次乳化1015s，然后置冰箱lmin左右。反复乳化 34次即可完全乳化。管残余 量800r/min 离心510mi

13、n 收集。* 优点：简单、快速、节省材料。 乳化剂的鉴定* 判断乳化是否充分，可将一滴乳化好的液体滴在水面上 （ 冷水中 ） ，如能长时间保持圆珠 形而不散开，表示乳化达到要求。（3）免疫方法 免疫途径* 常有静脉、腹腔、肌肉、皮下、皮、淋巴结、脚掌等注射。* 一般采用多点注射方法- 常在足、掌、腋窝淋巴结周围、背部两侧、颌下、耳后等处的皮或皮下。- 皮易引起细胞免疫反应，有利于提高抗体的效价。（3） 免疫方法 免疫途径 （续）* 几点说明：- 大动物一般不用腹腔注射- 颗粒抗原和使用佐剂时不能静脉注射- 抗原宝贵可采用淋巴结微量注射法，只需 10 100 g 抗原即可获得较好的免疫效果。-

14、皮注射较困难，特别是天冷时更难注入。（3） 免疫方法 次数及间隔时间* 次数一般为 23 次（初次免疫和加强免疫 ）-首次注射后， 1015 天再加强注射；- 剂量同首次或为首次的一半，用不全佐剂或不用佐剂。* 间隔时间，一般而言，动物越大，间隔越长- 豚鼠、大鼠为 7 8 天，兔子为 10 15 天，羊为 14 28 天；- 第三次注射的间隔时间更长些，效果更好。举例 1 ：家兔的免疫* 初次免疫-用50200 g Ag 加入 FCA ，在背部皮下注射 68 点，每点 0.1 0.2ml ，也可肌肉 或皮注射；* 两周后，加强免疫-将50200 g Ag于PBS或FIA中，在肌肉、皮下、静脉

15、或腹腔注射；1:4000 以* 抗体效价的检测：加强免疫一周后，耳缘静脉采血 -抗体效价测定可用环状沉淀试验、琼脂双向扩散法等方法。前者抗体效价在 上，后者在 1:16 以上，即可采血，取血清进一步提纯。 举例 2：微量抗原淋巴结注射免疫家兔* 一般选择2.53.0kg的新西兰种公兔- 先在其两脚垫注射完全福氏佐剂 0.2ml（ 卡介苗每兔合 5mg） ； -10 天后，见胭窝淋巴结肿大，然后将抗原注射至肿大的淋巴结，第一次注射抗原用完全 福氏佐剂混合乳化；-以后每隔 20 天用不完全福氏佐剂乳化抗原，以同样方法加强 2 次，各次注射的抗原均 为 25 50 g ；-末次注射两周后兔耳放血测价

16、 （ 可达 1:128） 。举例 3 ：豚鼠和大鼠的免疫* 初次免疫-用 10 100 g Ag 加入 FCA ，在背部皮注射 46 点，每点 0.lml ，也可肌肉或皮下注 射；* 加强免疫-每隔78天，将1050 g Ag于PBS或FIA中。在肌肉、皮下或静脉注射；* 抗体效价的检测（4）免疫剂量* 抗原性强的抗原量应小，过大反会引起免疫抑制；* 免疫周期长的动物可少量多次注射，短的可大量少次。（4） 免疫剂量 （ 续 ）* 各种动物首次免疫抗原剂量和加强免疫的剂量（5）抗体效价的检测 多采免疫双向扩散法 【基本原理】* 指抗原和抗体在同一凝胶都扩散，彼此相遇后形成特异性的沉淀线。 -将抗

17、原与抗体分别加入同一凝胶板中两个相隔一定间距的小孔，使两者进行相互扩散， 当抗原抗体浓度之比相适宜时，彼此相遇形成一白色弧状沉淀线。* 优缺点：简便，但敏感性较低，易出现假阴性结果。 免疫双向扩散法的操作步骤* 将玻璃板用水洗净后用 75 乙醇冲洗，晾干后放在水平台上备用。*将1 % agar融化后，置56 C水浴。* 在玻璃板上铺胶，约 1.5mm 厚，凝固后打孔 （直径 3rnm） ，孔间距 10mm 。* 中心孔加 5 l 抗原样品，周围孔每孔加 5 l 抗血清 （抗体预先作系列倍比稀释即 1:2 、 1:4 、 1:8 、 1:16 、 1:32 等比例 ） 。* 凝胶板置湿盒，室温扩

18、散 24h 。* 观察结果。 抗体效价检测的其它方法* 环状沉淀试验，需较多的抗血清，现已很少用；* 对流免疫电泳，比琼脂免疫双扩散法敏感，较简便、实用；* 酶联免疫吸附试验 （ELISA） 。放血或定期抽血常用以下 3 种方法* 颈动脉放血法：放血量较多，动物不易中途死亡。例如： 2.5kg 白兔可放血约 80ml 。 家兔、山羊、绵羊等动物采血常用此法。* 心脏采血法：常用于家兔、豚鼠、大白鼠、鸡等小动物，但操作不当易引起动物死亡。* 静脉采血：家兔可用耳缘静脉采血；山羊、绵羊、马和驴可用颈静脉采血，这种放血法 可隔日 1 次，有时可采集多量血液。放血或定期抽血 （ 续 ）* 采血过程中，

19、动作要轻柔，尽量避免溶血* 血液凝固后，及时离心收集血清，否则细胞溶解释放的杂蛋白 （ 例如蛋白水解酶 ） 将污染 抗体并将抗体水解，降低效价；* 加叠氮化钠，分装，低温保存，也可加一定的保护剂如 BSA 、甘油等。 二、组织和细胞标本的制备* 标本制备恰当，是免疫组化成功的首要条件* 免疫组化对组织和细胞标本的要求 -保持所检标本原有的结构、形态；- 在原位最大程度地保持待测抗原 （或抗体 ）的免疫活性，既不淬灭、流失或弥散，也不被 隐蔽。* 免疫组化的组织和细胞标本，制作流程与常规处理方法基本相同，但对组织、细胞的处 理又有其特殊要求及注意事项。-各种抗原由于其含量及特性的差异对标本处理方

20、式常有不同要求，因此要选择适用于本 实验的最佳方法。免疫组化中常用的组织和细胞标本* 组织标本-石蜡切片- 冰冻切片* 细胞标本-组织印片- 片（细胞爬片 ）- 细胞涂片（ 一） 石蜡切片* 石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法 -最大优点是组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察； -石蜡块还能长期存档，供回顾研究。* 石蜡切片制作过程对组织抗原显现有一定的影响，但可通过某些措施予以改善，因而它 是大多数免疫组化中首选的组织标本制作方法。1 、取材的特殊要求及注意事项* 标本新鲜： 一般在 2h 以进行， 超过 2h ，组织将有不同程度的自溶， 其抗原或变性消失， 或严重

21、弥散。* 取材部位：除取病灶或含待检抗原部位外，还应取病灶与正常交界处，即所取组织切片 中同时应有抗原阳性和阴性区，以形成自身对照。-细胞坏死后，不仅抗原弥散或消失，而且常引起非特异着色，干扰观察，因此取材时应 尽可能避开坏死区。1 、取材的特殊要求及注意事项 （续）* 避免挤压：取材时组织受挤压可使边缘部细胞形态改变并加深非特异着色，因而取材时 应使用锋利的刀刃；-镊取组织动作要轻；-经窥镜直接钳取的组织往往有过度挤压，观察结果时应有所考虑。2 、固定及常用的固定液* 取材后的组织需立刻投于固定剂中-固定使组织和细胞的蛋白质凝固，终止源性或外源性酶反应，防止组织自溶或异溶，以 保持原有结构和

22、形态；- 对免疫组化而言更有原位保存抗原的作用，避免抗原失活或弥散。* 常用固定液：固定剂品种很多，但大多属于醛类和醇类。其固定原理不同，各有优缺点。-醛类（常用甲醛、戊二醛和多聚甲醛）-醇类（常用乙醇）- 其它 （丙酮）（1）醛类*甲醛（福尔马林 ）应用最广-原理：形成分子间的交联，影响蛋白构型而使之固定。-优点：形态结构保存好，且穿透性强，组织收缩少。- 缺点：* 甲醛放置过久可氧化为甲酸，使溶液 pH 降低，影响染色；* 醛基与抗原蛋白的氨基交联形成羧甲基，使抗原决定簇的三维构象出现空间障碍；* 分子间交联形成的网格结构可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇，使之不能充分暴露。 可造成假阴性的

23、染色结果。- 注意事项：* 缩短固定时间，降低固定温度 （4 C） ，为此组织块不宜过厚。10甲*改用中性缓冲福尔马林，以pH值7.27.4 0.01mol/L的磷酸盐缓冲液配制成醛固定液，减少固定液 pH 的变化。* 固定后充分水洗以减少分子间交联。* 切片在作免疫组化染色前，先经预处理使抗原再现 （ 抗原修复 ） 。* 戊二醛：- 穿透性强，微细结构保存好，但对抗原有一定影响，常与其他固定剂联合用作免疫电镜 固定液。* 多聚甲醛 （ 常用 4%） ：-可用于免疫电镜；也可用于免疫荧光染色。* 主要检测组织一些性能娇弱的抗原特别是细胞表面抗原，例如各类淋巴细胸分化决定簇 (CD) 、主要组织

24、相容性抗原等。(2) 醇类* 最常用的醇类固定剂是乙醇。-其固定作用：使细胞蛋白、糖类发生沉淀。 -优点：穿透性强、抗原性保存好。- 缺点：* 脱水性强，易引起组织收缩、变硬，影响切片质量，因而乙醇固定时间不宜过长* 乙醇使蛋白变性的作用轻，固定后可再溶解；染色过程中，温育时间长，抗原可流失而 减弱反应强度。(3) 其它固定剂* 丙酮：- 对抗原性的保存好，但脱水性更强，较少 用于组织标本，但细胞爬片常用丙酮固定。3 、抗原修复 原因* 常规的石蜡切片标本均用甲醛固定，结果使得： -抗原性物质形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇； -蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。* 要求：在染色时，

25、需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏， 而恢复抗原的原有空间形态。3 、抗原修复 方法* 化学方法* 加热方法- 水浴加热法-微波照射法- 高压加热法-酸水解法(1) 化学方法* 主要是通过一些酶的作用，使抗原决定簇暴露。常用的酶有：胰蛋白酶、胃蛋白酶等。-胰蛋白酶：一般使用浓度为0.05 %0.1 %，消化时间为 37 C, 1040min ,于细胞抗原的显示；-胃蛋白酶：一般使用浓度为 0.1% 0.4 %，消化时间为 37 C、30180min ， 于细胞间质抗原的显示。* 例如： Laminin 、 CollagenIV(2) 水浴加热法* 将玻片放入装有抗原修复液的容器中，加热至沸腾，持续10 15 分钟。- 优点：操作简单、经济，适用于所有的实验室，- 缺点：对封闭牢固的抗原决定簇暴露不理想。(2h) 。主要用主要用(3