组织工程中蛋白高聚物法合成水凝胶

1、组织工程中蛋白高聚物法合成水凝胶Maya Gonen-Wadmany, Liat Oss-Ronen, Dror Seliktar摘要胶原蛋白，纤维蛋白和白蛋白正在被用做组织工程中的生物支架材料，因为它们的生物相容性，生物可降解性并且它们很容易获得。以生物蛋白为基础的生物材料的主要缺点是缺少对他们自身和生物降解性能的有效控制。我们的实验室一直在发展在无细胞毒性蛋白质交联技术之上的以可调谐特性的新蛋白质为基础的生物材料。我们实现了以蛋白质聚合物复合物（聚乙二醇）和胶原蛋白，纤维蛋白或白蛋白为基础的光聚合仿生支架水凝胶的形成和装配。PEG和这些蛋白质的共轭在剪切流变之后与SDS - PAGE和凝胶

2、网络的聚合是同一个反应。三个水凝胶材料的流变学和膨胀特性的差异，使聚乙二醇和蛋白质的排列成分关系变得重要。聚乙二醇胶原蛋白和纤维蛋白原凝胶的生物功能维持了细胞的粘附和蛋白退化，阻止了细胞在水凝胶网络内的3 - D扩散和迁移。聚乙二醇白蛋白水凝胶拥有很少的细胞迁移和扩展能力是因为没有任何已知的白蛋白骨干细胞粘附站点。尽管聚乙二醇化胶原蛋白和水凝胶纤维蛋白原的生物组成和结构不同，但在每个细胞内物质的迁移率差异却不显著1. 简介天然细胞外基质（ECM）的蛋白质被广泛用于制作组织工程和再生医学生物材料的支架。这些纯化和重组的细胞外基质蛋白可以与内在引导重塑的信号和功能性细胞组织形成独特的三维结构水凝胶

3、耦合矩阵。生物支架材料很容易用胶原蛋白或纤维制成，而胶原蛋白和水凝胶都是有着众多体外和体内应用的蛋白质1。从液态转变到固态（凝胶）的可溶性蛋白凝胶前体是有利于组织工程的，因为它们可以在细胞，可溶性生长因子，或活体组织（在原位聚合）里以矩阵的形成存在。由蛋白质凝胶所组成的3D环境可以支持细胞增殖以及有效的重组直到转变成多层次的组织和器官4。出于这个原因，孔径的大小，透气性，材料表面特性对于巧妙地这个重塑都很重要5,6。在同一时间，材料的细胞外基质骨干可以指导细胞进行重要的表型转变7。使用外源性蛋白或重组蛋白，如胶原蛋白或纤维蛋白作为组织工程支架会有一些缺陷，其中就包括聚合网状结构的物理性质和生物

4、降解。举例来说，胶原蛋白凝胶制成的纤维网络，具有较差的机械强度和足够的生理组织孔隙率。细纤维与孔洞结构相结合的交叉结构使得蛋白胡子古干容易从周围宿主组织或细胞培养系统中向四周西游扩散。这往往存在于细胞分泌的失控或过早恶化的蛋白酶中3,8,9。但凝胶的结构不完善且蛋白易水解，与自然组织相比仍有许多工作有待从实际的组织工程生物支架系统中吸取经验。有一系列用于改善重组蛋白水凝胶以防止它们的理化性质迅速退化的技术。改进蛋白物理性质的技术是以包括醛，碳二亚胺和氮羟基琥珀酰亚胺（NHS）10,11等的共价交联为基础的。许多交互相联的步骤为提高结构的物理稳定性和降低酶的感受性做了一定的改善，为了达到这样的结

5、果可以通过引进一种细胞毒素的制造机构且在大量洗涤之后使得残余的细胞毒素能够影响细胞的活性3,12。胶原蛋白和纤维蛋白也可通过冷冻干燥以增加拉伸强度和蛋白网络的系数13-15。然而，冷冻干燥就必须预先进行冷冻步骤，这样就降低了了细胞凝胶聚合物存在的可能性，但也失去了在原位固定的好处。可以使用如聚乙二醇的屏蔽聚合物的共价结合来阻止支架蛋白的蛋白质降解来保护蛋白支柱。蛋白质经过聚乙二醇添加修饰后可以增加治疗蛋白和蛋白类药物一般的血浆量16。同理可推，聚乙二醇化可能是生物蛋白设计的一个突破口。例如可以降低基于蛋白质的生物骨架的降解速度。并且，聚乙二醇链无毒，无免疫原性，很好的水溶性，并已通过了美国FD

6、A的多次临床测试20.在支架设计中常见的蛋白质可以随时使用氨基聚乙二醇化来修改骨干的蛋白质巯基，以产生蛋白质的共轭聚合物21,22.聚乙二醇通过对酶空间阻碍来保护蛋白而不阻止结构蛋白质的天然生物功能20.在本次调查中，我们描述了蛋白质聚合物复合物的形成，并将其纳入组织工程仿生水凝胶支架工程中。三种生物医学蛋白质，包括胶原蛋白，纤维蛋白（原），白蛋白可以通过聚乙二醇的自由基聚合形成凝胶网络。在二维和三维的环境下，这三个生物材料在平滑肌细胞（SMCs）中进行了长达一个星期的表征和测试。并记录和总结了单元格内的种子细胞重塑的可行性和流动性。2.方法2.1聚乙二醇二丙烯酸酯的合成聚乙二醇二丙烯酸酯（P

7、EG - DA）是以线性PEG-OH MW ¼ 10 kDa (Fluka, Buchs, Switzerland)作为起始原料的30。总之，聚乙二醇-羟基的丙烯化是在氩气中和聚乙二醇-羟基溶液中的丙烯酰氯(Aldrich, Sleeze, Germany)反应的。最终产品是沉淀在冰冷的乙醚下真空干燥48小时后用核磁共振来验证端基转换并验证最终了产品的纯度。2.2.纤维蛋白原，白蛋白，聚乙二醇纤维蛋白原和白蛋白的聚乙二醇化是根据Dikovsky等人所详细描述的一个聚乙二醇化的方案来制定的18。三（2 -羧乙基）膦盐酸盐（乙基-盐酸）（Sigma - Aldrich公司）被添加到150

8、mm的7mg/ml纤维蛋白原（Sigma - Aldrich公司）或牛血清白蛋白（MP的Biomedicals，俄亥俄，美国）溶液磷酸盐缓冲液（PBS）与8M的尿素（摩尔比为1.5:1或2:1乙基纤维蛋白原或白蛋白半胱氨酸，分别）。线性10 - kDa的PEG- DA的蛋白质以4:1或2:1摩尔比与PEG或白蛋白半胱氨酸纤维蛋白原反应3 h。该产品是聚乙二醇化蛋白质丙酮沉淀在PBS中含有尿素800M在7mg/ml的最终纤维蛋白原浓度和2mg/ml的最后白蛋白浓度重溶解的。透析的蛋白产物在4 1C号对PBS为2个D（频谱，12 - 14 - kDaMW截止，加利福尼亚州，美国）。聚乙二醇化白蛋白

9、浓缩至8mg/ml后冻干和重组。聚乙二醇化产品的特点与已公布的协议相符18。2.3.胶原的聚乙二醇化胶原蛋白（I型）是根据已公布的协议从鼠尾肌腱分离的23。胶原蛋白的巯基化的完成是根据Chen等人的协议使用succinimidylacetyl - thioacetate（SATA接口，皮尔斯，美国伊利诺州）完成的24。简单地说，胶原蛋白与8M的尿素溶解在浓度为5mg/ml的150毫米的PBS里。SATA是在室温下反应2 h浓度为0.075mg/ml的胶原蛋白。由此产生的乙酰化赖氨酸残基在SH群体，然后在0.125mg/ml胶原浓度（盐酸羟胺，Sigma - Aldrich公司）脱保护与0.5M

10、的盐酸羟胺反应2 h。该产品是针对透析过夜PBS和8M的尿素和乙基-盐酸（摩尔比为2:1与新的胶原蛋白乙基硫醇），10 kDa的聚乙二醇达（摩尔比为1.5:1的PEG DA与新的胶原蛋白硫醇）在聚乙二醇化pH值8并3小时逆转录胶原蛋白的聚乙二醇化丙酮沉淀和尿素重溶解 PBS和800万，并以幻灯片透析- à - Lyzer 37 1C号（万截留分子量，皮尔斯，IL，美国）2 d到一终浓度为4mg/ml胶原。该产品的特点是聚乙二醇化聚乙二醇作为纤维蛋白原相同。2.4. SDS-PAGE电泳一般把聚乙二醇和非聚乙二醇的蛋白注入在含8%凝胶的泳道上进行电泳来完成聚乙二醇化。凝胶用考马斯蓝染色

11、后后并用凝胶成像数字文档工作站成像。2.5.水凝胶的形成聚乙二醇化的蛋白质可以用光聚合反应合成水凝胶，该反应需要0.1% (w/v) IrgacureTM2959 (Ciba Specialty Chemicals, Basel, Switzerland)并在紫外线(365 nm, 45mW/cm2)下曝光五分钟。所有的组织培养实验都添加4mg/ml聚乙二醇化蛋白前体和10-kDa的线性PEG-DA（10mg/ml）。水凝胶的形成正符合应变率控制剪切原理。动态时间板块几何扫描测试是在37 1C，以1 rad / S和正弦5应变常数下采用了先进的流变扩展系统（阿瑞斯，流变仪科学）来进行的。在RS

12、I Orchestrator 软件中记录存储（G0）和损耗（G00）模量的时间需要10分钟。120秒后的处理办法是用紫外线光源（20mW/cm2）进行光聚合。2.6.膨胀和降解特性肿胀反应实验在100ml的聚乙二醇蛋白凝胶前提聚合而成的圆柱形塞状体（5mm 直径）上进行的。水凝胶塞状体放置在含有0.1% 的叠氮钠的10ml PBS中在室温下反应24h。在进行整夜的冷冻干燥之前测量每一个塞状体的湿重。膨胀系数可以通过湿重和干中的比较计算出来。另外一个膨胀系数，体积系数百分比，是塞状物的最终体积与铸造前的体积的增长比值(Vf/Vi100)。根据佩莱德等人的资料来看，将对脱细胞荧光标记的聚乙二醇化蛋

13、白质凝胶圆柱状物进行生物降解实验25。简单来说，琥珀酰亚胺吖啶- 9 -羧酸(SAC, Pierce, IL, USA)会在PBS和DMSO（0.1 mg/ml）中重组并进行SAC染色方案。每个柱状物先是用SAC染色液过夜然后用大量的PBS和含0.1叠氮化钠的溶液洗涤3天。每个柱状物培养在3ml的含0.01 mg/ml 胶原酶和0.1叠氮化钠的IA型溶液中（Sigma-Aldrich），并在371 oC中在连续搅拌。Varioscan光谱扫描多模器（Thermo Electron Corp）是用来衡量的荧光强度（激发波长364 nm，发射波长460 nm）的，5分钟一次共10小时25。2.7.

14、细胞基质的制备（2-D）用聚乙二醇化蛋白质制成的水凝胶被用作平滑肌细胞（SMCs）的2-D栽培基质。为此，绵羊主动脉平滑肌细培养至第八代，用的是含10胎牛血清（FBS）的（Biological Industries），1的青霉素，链霉素(Biological Industries)，1L -谷氨酰胺(Biological Industries)的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM培养基）（Gibco，UK）。水凝胶前提的原材料是聚乙二醇化蛋白质溶液（4mg/ml），10-kDa的线性聚乙二醇-DA（10mg/ml）和光引发剂（0.1w/v）。将该凝胶放置在一个24孔板的底部并接种在

15、平滑肌细胞（70,000细胞/孔）的1毫升培养液上。进行了细胞扩散后立即用相差显微镜（Nikon Eclipse TS100）和细胞形态与数字CCD相机记录并监测细胞的生长效果。2.8. 细胞扩散的准备(3-D)细胞扩散培养是由溶解在聚乙二醇化蛋白质溶液中的分散的羊主动脉平滑肌细胞经过光聚合而成的。通道蛋白（P4-P8）在经过胰酶消化处理后悬浮在300ml的含有光引发剂（0.1 w/v）的聚乙二醇蛋白溶液（0.5-106 cells/ml）里。放在圆柱型胶囊材料里的蛋白将通过相位差显微镜进行每天的观察和记录。连续监测的一些实验用到的是定制的时间推移孵育显微镜系统（Nikon Eclipse T

16、E-2000）。可视化实验设想在几个位点通过消去羟基来重塑活跃的细胞并对每个位点进行没10分钟一次的拍照至96小时（附录A）。2.9.细胞生长研究细胞生长实验采用组织结构致密的SMC-种子胶原蛋白，包裹在聚乙二醇化的蛋白水凝胶内。这种胶原蛋白基础的组织是用5X DMEM（生物产业产品），10 FBS，再造的型胶原溶解在0.1 N的乙酸（2mg/ml），和0.01M NaOH和分散绵羊主动脉平滑肌细胞（0.5-106 cells/ml）。细胞接种胶原凝胶在500毫升的培养基中培养2d，之后将致密的组织放在300ml的聚乙二醇化蛋白质溶液里后放在48孔板上进行光引发。在紫外线下暴光5分钟后，将封装

17、的组织放在含有水凝胶的500毫升培养基内培养。每天监测和测量细胞的增长状况，从边缘的致密组织到聚乙二醇化蛋白质都要在设定的时间间隔内用相差显微镜测量细胞的平均增长长度。2.10.统计分析统计分析采用微软的Excel软件。对独立的实验数据进行了量化，并对每个变量都进行了分析。两种治疗方法的比较采用了学生的T检验（两位测鉴定，异方差），与复合治疗方法之间的比较则采用了方差分析（ANOVA）法。p值为o0.05的被认为是具有统计学意义的。3.结果3.1.胶原蛋白，纤维蛋白原和聚乙二醇化蛋白原蛋白质和PEG之间的迈克尔型加成用SDS - PAGE和Coomassies蓝染色检验并证实了。同等数量的纤维

18、蛋白原，白蛋白，及胶原（聚乙二醇和非聚乙二醇化）都通过分子量（MW）标记法用SDS - PAGE图谱进行了比较由于接连了聚乙二醇链（图1），聚乙二醇化后的各项性质显示了蛋白质在聚丙烯酰胺拥有明显的流动性。一般来说，蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶流动性与MW有关，因此未聚乙二醇化的蛋白质在丙烯酰胺凝胶中就会有一个更好的流动性26,27。与纤维蛋白原和胶原蛋白相比，聚乙二醇化在MW上拥有明显的提高，这在连续涂抹凝胶最上面的部分之后尤其明显。一些为聚乙二醇化的蛋白质中，纤维蛋白原的峰值在50 kDa左右，白蛋白的在150 kDa左右。白蛋白聚乙二醇化实验中存在大量的共轭蛋白质使蛋白质固定在聚丙烯酰胺凝胶的装

19、载部分（上方），因此没有在运行凝胶中观察到现象。图1流变数据可以用来确认水凝胶网络中的聚乙二醇化蛋白前体向聚合水凝胶的过度。应变速率流变仪的数据显示，在紫外线灯打开之后（箭头）聚合立即发生，并在3分钟内达到高原储能模量值（G0），从而表明这是快速的聚合反应（图2A）。聚乙二醇化蛋白质凝胶前体的形成与高原G0值均列于表1。聚乙二醇纤维蛋白原水凝胶的弹性相对于聚乙二醇胶原蛋白和PEG -白蛋白水凝胶而言是最高的，尽管只有最低浓度的PEG。PEG -胶原蛋白和PEG -白蛋白水凝胶载在相同的聚乙二醇浓度下，PEG -胶原蛋白水凝胶有着明显更高的G0值（po0.05）。表A表B图23.2.溶胀和降解性

20、能聚乙二醇，胶原蛋白，聚乙二醇和聚乙二醇纤维蛋白原，白蛋白水凝胶的溶胀比（Q）如图2B所示。在Q上有显著差异的是聚乙二醇化蛋白质原料（po0.05，nX6），聚乙二醇水凝胶纤维蛋白原与聚乙二醇白蛋白水凝胶相比有两倍的增幅。聚乙二醇化蛋白质材料还有显著的体积百分比差异（po0.05，nX6）。与聚乙二醇白蛋白水凝胶相比上升183，完成后肿胀115和55为聚乙二醇和聚乙二醇胶原纤维蛋白原凝胶。聚乙二醇化蛋白质水凝胶中的胶原酶生物降解动力学的解决办法是报道的几倍。三种材料之间存在显著的生物降解动力学差异（po0.05，n46）。聚乙二醇胶原蛋白降解速度最快，在胶原酶溶液中水凝胶制成的水凝胶聚乙二醇白

21、蛋白退化最慢。3.3.细胞培养实验培养的平滑肌细胞进行水凝胶薄层材料能力的评估表明，其支持骨干蛋白细胞的粘附。一个简易的附着力实验如图4所示。在播种后2小时和24小时测量时，这些细胞都没有扩散在聚乙二醇白蛋白水凝胶上（图4A和B）。与此相反，细胞在聚乙二醇和聚乙二醇胶原纤维蛋白原水凝胶上会立即开始传播（图4c和E）。组织培养塑料（TCP）和聚乙二醇水凝胶只分别为阳性和阴性对照（未显示）。3 - D培养实验是的三种材料是通过把SMCs分散到水凝胶前体溶液中，并把细胞悬浮液聚合和封装在基质的细胞中。在实验开始时，将原本为圆形的细胞在聚乙二醇-白蛋白，聚乙二醇-胶原蛋白，和聚乙二醇-纤维蛋白原水凝胶

22、中聚合（图5A，D，G）。4小时后，在聚乙二醇胶原蛋白和聚乙二醇纤维蛋白原中的圆形细胞开始形成扩展（图5E，H），而在聚乙二醇白蛋白中的细胞仍保持圆形（图5B）。24 小时候，在聚乙二醇胶原蛋白和聚乙二醇纤维蛋白原水凝胶中细胞扩散成为锭子状（图5F，I），而在聚乙二醇白蛋白水凝胶中，细胞仍然成圆形并没有形成到矩阵扩展（图5C）。连续的显微镜观察视频显示，在第一个24小时内在无水凝胶情况下细胞发生了扩散，这显示在一个补充视频序列中（附录A）。在视频中，SMCs由他们的最初形态圆形变成了最终的梭形，在无聚乙二醇胶原和聚乙二醇纤维蛋白原材料的稠密矩阵内。在聚乙二醇白蛋白水凝胶中的SMCs始终保持圆形

23、，在整个试验持续时间里。图33.4.组织生长实验致密的SMCs种子胶原凝胶包埋在聚乙二醇蛋白水凝胶中，他们的细胞生长长达五天时间（附录A）。在整个实验过程中，SMCs在开始被投入到聚乙二醇纤维蛋白培养基中就开始持续不断地入侵到培养基中。与聚乙二醇纤维蛋白相比，聚乙二醇胶原水凝胶中的SMC细胞并没有持续入侵基质。聚乙二醇胶原和聚乙二醇纤维蛋白原中入侵细胞形态基本相似。并没有细胞入侵到聚乙二醇白蛋白水凝胶中。SMCs细胞进入聚乙二醇胶原凝胶和聚乙二醇纤维蛋白原凝胶的运移距离测量结果显示，两者的迁移率基本相似（图6）。4.讨论胶原和纤维在组织重生中是常用的生物材料，因为他们对蛋白酶有很好的敏感性并且

24、有很好的生物活性。这些以生物蛋白为基础的生物材料的主要缺点是缺乏对其对物理和降解性能的有效控制，这会导致在细胞和组织的基质中过早的分解。我们的实验室已经开发出一种以蛋白质为基础的材料，这种材料用聚乙二醇化的方式提高了结构的性能和降解可控性28。我们之前已经报道过聚乙二醇纤维蛋白原凝胶29，现在我们也证明了可以将聚乙二醇胶原和白蛋白材料用于细胞培养的能力。这三种蛋白质的聚乙二醇化是通过迈克尔型加成反应完成的，在非自然蛋白质的未成对半胱氨酸残基的自由巯基和未饱和双键在功能性PEG-DA上共价结合。为此，需要修改的胶原分子使用的是SATA反应计划，介绍乙酰化赖氨酸残基上的巯基24 。SDS - PA

25、GE电泳是用来确定每个蛋白质聚乙二醇的反应。剪切流变仪是用来验证聚乙二醇化蛋白在紫外光和光引发剂存在下水凝胶前体的水凝胶网络的形成。挑选对于聚乙二醇化蛋白质的最佳方法取决于蛋白共轭聚合物所需的属性，它受到聚乙二醇的附着位置，类型影响16。通常情况下，对聚乙二醇化蛋白质结合的生物学功能是在确定PEG化方法的最重要因素。我们选择我们在支架系统蛋白质合成巯基聚乙二醇化的方案。不像肽或蛋白质药物治疗，一些生物活性作为对如胶原蛋白，纤维蛋白的聚乙二醇或白蛋白结构造成的损失小于不利于一个组织工程支架的设计。不过，重要的是要认识到聚乙二醇化的好处和生物活性亏损余额可以更精确调节。经研究表明，聚乙二醇化蛋白前

26、体可以形成一个细胞支架原位聚合在SMCs上。我们的反应条件是细胞暴露在紫外线灯（365纳米，4-5 mW/cm2）下，并加入了PBS，超额光引发剂（0.3 w/v），过量的光引发剂（0.3 W/ V）和聚乙二醇化蛋白质溶液（4mg/ml）中。SMCs悬浮在PBS上，但不暴露在紫外线下被作为阴性对照。聚乙二醇蛋白在光引发剂和紫外线的存在下，平滑肌细胞存活率，类似的以紫外线灯或光引发剂（80，p40.05，nX12）对照组。紫外线灯或光引发剂的存在使得无生存能力的SMC减少61。我们的调查显示，聚乙二醇蛋白水凝胶生物材料的最终目标是替代以蛋白为基础的组织工程生物材料支架以及由不同的重组胶原蛋白和纤

27、维蛋白4,32形成的纤维网，聚乙二醇化蛋白质水凝胶形成的高密度封装非晶基体的细胞18。需要适当的细胞重塑细胞矩阵，是由细胞表面粘附分子的相互作用提供的。纤维蛋白原和胶原蛋白都与细胞粘附编码序列，如精氨酸，甘氨酸，天冬氨酸，这是促进蛋白质凝胶（二维文化）的能力。聚乙二醇白蛋白不包含SMCs粘附时，SMCs附着任何已知领域，这可能解释了细胞可以在聚乙二醇白蛋白水凝胶缺乏培养基上培养的原因。图4图4蛋白降解的生物材料是另一种方便有效的细胞重塑材料。在聚乙二醇化蛋白质生物材料的设计里，减少了聚乙二醇化蛋白质对酶的易感性22，并提供了对聚乙二醇蛋白质成分为基础的生物降解性材料控制能力35。聚乙二醇白蛋白

28、水凝胶展示了胶原酶最长的半衰期，这表明细胞可能会遇到比用重塑的PEG -纤维蛋白原和PEG -胶原蛋白水凝胶材料更困难的问题。 最后，重要的是要注意作比较。胶原蛋白，纤维蛋白原，白蛋白聚乙二醇化产生的蛋白浓度和PEG浓度（表1）在水凝胶前体方面显著不同。在对水凝胶三者之间进行的有意义的比较里，至少需要对材料的参数之一保持不变（即蛋白浓度或聚乙二醇对蛋白质的比例）。未反应的聚乙二醇附加值增加了前体溶液（1 w/v）中的有效交联的聚乙二醇化蛋白的浓度，可能导致这些凝胶蛋白浓度相对较低。相同的蛋白质浓度的水凝胶含有不同的聚乙二醇对蛋白质的摩尔比。聚乙二醇对蛋白质的相对数量会对交联密度，生物活性和生物

29、降解材料的动力学结构性能产生重大影响。图55.总结以蛋白为基础的生物合成材料的研发目的是为了制造出能模仿ECM的生物特征并拥有可控的性能和生物降解性。使用聚乙二醇化的纤维蛋白、胶原或者白蛋白制造的生物材料能够保持蛋白的粘附力并能提供基于蛋白骨干的生物可降解性。这些材料的生物活性骨干也保证足够的生物活性和充分的生物相容性。聚乙二醇成分的合成提供了控制酶生物降解并且不引入额外的交联步骤从而保持结构性能的材料的可能性。这种合成聚合物的组合与重组蛋白为支架的设计能够有效提高天然蛋白质为基础的组织工程和再生支架材料的作用。申明 感谢以色列科学基金会提供的资助(Grant no. 1140/04)。附录A

30、补充资料与本文相关的补充资料的网络版分类号：10.1016/j.biomaterials。引文1 Lutolf MP, Hubbell JA. Synthetic biomaterials as instructive extracellular microenvironments for morphogenesis in tissue engineering. Nat Biotechnol 2005;23(1):4755.2 Herrick S, Blanc-Brude O, Gray A, Laurent G. Fibrinogen. Int J Biochem Cell Biol 199

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