第七章2病毒分离鉴定

1、第三节第三节 病毒分离及鉴定病毒分离及鉴定要证明某种疾病是由某一感染性病毒所引起，则必要证明某种疾病是由某一感染性病毒所引起，则必须满足以下原则：须满足以下原则：从患病者体内分离出病毒；从患病者体内分离出病毒；在实验动物或寄主细胞中可以培养；在实验动物或寄主细胞中可以培养；证明这种培养物具有滤过性；证明这种培养物具有滤过性；在原始宿主或相关种属内能产生同样的病症；在原始宿主或相关种属内能产生同样的病症；能重新分离出病毒能重新分离出病毒. .病毒材料采集与检验结果的关系病毒材料采集与检验结果的关系采取标本的时期采取标本的时期检查病毒及其成分检查病毒及其成分测定抗体测定抗体潜伏期及前驱期潜伏期及前

2、驱期刚刚发病或急性期发病或急性期恢复期及康复期恢复期及康复期较难查见较难查见最多查见最多查见很难查见很难查见未增多未增多未增多或增多未增多或增多不明显不明显明显增多明显增多（常超过（常超过4 4倍）倍）一、标本的处理一、标本的处理（一）除菌处理（一）除菌处理 n 粪便可加青链霉素使最终浓度为粪便可加青链霉素使最终浓度为1000010000单位单位/ /毫毫升，置升，置44过夜。过夜。n 鼻咽拭子一般加抗生素最终浓度为鼻咽拭子一般加抗生素最终浓度为20002000单位单位/ /毫毫升，置升，置44作用作用4 4小时。小时。n 对乙醚有抵抗的病毒如鼻病毒、肠道病毒、呼对乙醚有抵抗的病毒如鼻病毒、肠

3、道病毒、呼肠孤病毒、腺病毒、痘病毒等，则可加入等量的肠孤病毒、腺病毒、痘病毒等，则可加入等量的乙醚乙醚44过夜除菌。过夜除菌。（二）研磨和稀释（二）研磨和稀释 对脑、脊髓等组织标本首先应经研磨器或乳钵中对脑、脊髓等组织标本首先应经研磨器或乳钵中充分研磨后，加稀释液（充分研磨后，加稀释液（pH7.6pH7.6肉汤或肉汤或1010脱脂牛脱脂牛乳生理盐水或乳生理盐水或0.50.5水解乳蛋白水解乳蛋白HanksHanks液）制成组液）制成组织悬液，然后经织悬液，然后经20002000转分离心转分离心2020分钟。必要时分钟。必要时可加抗生素处理（同上）。可加抗生素处理（同上）。 病毒是严格的细胞内寄生

4、微生物，培养病病毒是严格的细胞内寄生微生物，培养病毒必须使用细胞。根据病毒的不同选用敏毒必须使用细胞。根据病毒的不同选用敏感动物（感动物（动物接种动物接种）、鸡胚（）、鸡胚（鸡胚接种鸡胚接种）或离体细胞进行分离培养（或离体细胞进行分离培养（细胞培养细胞培养）。）。二、病毒的分离培养二、病毒的分离培养(一）动物接种法一）动物接种法接种后通常以动物发病、死亡作为感染的指标。接种后通常以动物发病、死亡作为感染的指标。按病毒侵袭部位不同选择适当的按病毒侵袭部位不同选择适当的接种途径。嗜神经病毒接种在小接种途径。嗜神经病毒接种在小鼠的脑内。痘苗病毒和单纯疱疹鼠的脑内。痘苗病毒和单纯疱疹病毒接种于家兔角膜

5、。病毒接种于家兔角膜。动物接种的优缺点：动物接种的优缺点：优点：优点：（1）不需要复杂的仪器设备；不需要复杂的仪器设备； （2）技术简单；）技术简单； （3）易成功）易成功缺点：缺点：（1）个体差异大）个体差异大 （2）价格昂贵）价格昂贵 （3）数量有限）数量有限 （4）需要隔离畜舍）需要隔离畜舍（二）鸡胚接种（二）鸡胚接种 1. 鸡卵的选择鸡卵的选择 一般都选新鲜、一般都选新鲜、10天以内的受精卵以保证规格天以内的受精卵以保证规格质量上的一致质量上的一致 。2. 孵育孵育 孵育时可将鸡卵放入卵箱内进行孵育时可将鸡卵放入卵箱内进行,气室向上，孵气室向上，孵育的最适温度为育的最适温度为38-39

6、，相对湿度为，相对湿度为4070，孵育孵育8日后，鸡卵应每天翻动日后，鸡卵应每天翻动12次，以帮助鸡胚次，以帮助鸡胚发育匀称和防止鸡胚膜粘连。发育匀称和防止鸡胚膜粘连。3. 检卵检卵 鸡卵孵育鸡卵孵育45天后，即可用检卵器检查鸡胚发育情天后，即可用检卵器检查鸡胚发育情况（二天一次）。况（二天一次）。（1）未受精鸡卵：）未受精鸡卵：在检卵器上仅见到模糊的阴影。在检卵器上仅见到模糊的阴影。（2）活鸡卵：）活鸡卵：鸡胚发育鸡胚发育4天后，在检卵器上就可见天后，在检卵器上就可见到清晰的血管，鸡卵内有一小黑点（鸡胚），有到清晰的血管，鸡卵内有一小黑点（鸡胚），有明显的自然转动。明显的自然转动。（3）死胎

7、）死胎：如果发现鸡卵血管模糊、扩张、：如果发现鸡卵血管模糊、扩张、胚胎活动呆滞或不能自主地转动，则可判断胚胎活动呆滞或不能自主地转动，则可判断胚胎频死或已经死亡，应将其挑捡出来。胚胎频死或已经死亡，应将其挑捡出来。 鸡胚孵育完毕后，用铅笔划出气室边缘和鸡胚孵育完毕后，用铅笔划出气室边缘和胚胎的位置待用。胚胎的位置待用。鸡胚鸡胚羊膜腔羊膜腔接种：用接种：用12121414天鸡胚，将检天鸡胚，将检材注入羊膜腔，孵育材注入羊膜腔，孵育后取羊水检查（图后取羊水检查（图7-7-8 8）。常用于流感病）。常用于流感病毒的初次分离。毒的初次分离。鸡胚卵黄囊接种鸡胚卵黄囊接种：用：用5 58 8天鸡胚，以细长

8、针头由天鸡胚，以细长针头由鸡卵气室端刺入卵黄囊。鸡卵气室端刺入卵黄囊。孵育后取获卵黄囊膜检孵育后取获卵黄囊膜检查（图查（图7-77-7）。常用于某）。常用于某些嗜神经病毒的分离。些嗜神经病毒的分离。4.4.接种接种 绒毛尿囊膜绒毛尿囊膜接种：用接种：用1010l 2l 2天鸡胚，以无菌手续天鸡胚，以无菌手续在蛋壳上开在蛋壳上开小窗，然后小窗，然后将材料滴在绒毛尿囊膜上将材料滴在绒毛尿囊膜上孵育后。观察膜上有无孵育后。观察膜上有无斑点病变斑点病变( (图图7-10)7-10)。常用。常用于培养单纯疱疹病毒、天于培养单纯疱疹病毒、天花病毒和痘病毒。花病毒和痘病毒。尿囊腔尿囊腔接种接种 用用9 91

9、212天天鸡胚，将标本接种于尿囊鸡胚，将标本接种于尿囊腔腔, , 孵育后取尿囊液检查孵育后取尿囊液检查( (图图7-9), 7-9), 常用于培养流常用于培养流感病毒和腮腺炎病毒等。感病毒和腮腺炎病毒等。5.剖检及收获剖检及收获 收获前鸡胚应置收获前鸡胚应置4冰箱过夜，使鸡胚内血液冰箱过夜，使鸡胚内血液凝固。收获时，用碘酒将气室部卵壳消毒，将凝固。收获时，用碘酒将气室部卵壳消毒，将气室处卵壳剥去（不要将碎片落入壳膜）。然气室处卵壳剥去（不要将碎片落入壳膜）。然后用无菌手术刀柄从胚胎背部轻轻下压，（切后用无菌手术刀柄从胚胎背部轻轻下压，（切勿压破卵黄囊）再用吸管吸取尿囊液，置青霉勿压破卵黄囊）再

10、用吸管吸取尿囊液，置青霉素小瓶内，于低温保存。素小瓶内，于低温保存。鸡胚接种的优缺点：鸡胚接种的优缺点：优点优点：技术简单、来源充沛、价格低廉、数量技术简单、来源充沛、价格低廉、数量可大可大、不需特殊设备不需特殊设备 。 缺点：缺点：很多病毒不能适应，主要是哺乳动物的很多病毒不能适应，主要是哺乳动物的病毒。病毒。( (三）细胞培养三）细胞培养 根据细胞的类型和培养根据细胞的类型和培养细胞代数的不同，可将细胞代数的不同，可将其分为两种。其分为两种。 细胞培养细胞培养(cell culture)是指利用机械、酶或化是指利用机械、酶或化学方法使动物组织或传代细胞分散成单个乃至学方法使动物组织或传代细

11、胞分散成单个乃至24个细胞团悬液进行培养。个细胞团悬液进行培养。 原代细胞培养原代细胞培养 即从机体内取出细胞置试管或瓶内即从机体内取出细胞置试管或瓶内生长成单层细胞后，立即接种病毒，可用于产生病生长成单层细胞后，立即接种病毒，可用于产生病毒疫苗毒疫苗. .这种原代细胞为二倍体细胞，不能保存和这种原代细胞为二倍体细胞，不能保存和传代传代, ,故而不便用于诊断。常用的有鸡胚、猪肾和故而不便用于诊断。常用的有鸡胚、猪肾和地鼠肾原代细胞。地鼠肾原代细胞。传代细胞传代细胞 它是由二倍体细胞或癌细胞突变制成的它是由二倍体细胞或癌细胞突变制成的, ,染色体数为非整倍体染色体数为非整倍体, ,细胞随时可以获

12、得细胞随时可以获得, ,生长迅速生长迅速, ,可无限传代可无限传代. .细胞培养的方法细胞培养的方法静置培养：静置培养：实验室常用。细胞悬液装瓶，实验室常用。细胞悬液装瓶，5%5%COCO2 2温箱静置培养，细胞沉降并贴附在玻面上生长温箱静置培养，细胞沉降并贴附在玻面上生长分裂，最后长成单层。分裂，最后长成单层。旋转培养：旋转培养：大规模生产疫苗。细胞在玻瓶内生大规模生产疫苗。细胞在玻瓶内生长时，玻瓶不断缓慢旋转，细胞贴附于玻瓶四长时，玻瓶不断缓慢旋转，细胞贴附于玻瓶四周，长成单层。周，长成单层。组织细胞培养的病毒，当出现稳定的细胞病组织细胞培养的病毒，当出现稳定的细胞病变后，就可取培养液或培

13、养液与细胞培养物变后，就可取培养液或培养液与细胞培养物混和物，细胞培养物中的病毒可采用冻融、混和物，细胞培养物中的病毒可采用冻融、超声波等方法使其释放出来。超声波等方法使其释放出来。 病毒的获得病毒的获得优点：优点：每个细胞生理特性基本一致，对病毒易感每个细胞生理特性基本一致，对病毒易感性相等；性相等；无个体差异，准确性和重复性好；无个体差异，准确性和重复性好；可严格执行无菌操作；可严格执行无菌操作；细胞培养本身就能显示病毒的生长特征；细胞培养本身就能显示病毒的生长特征；应用空斑技术可进行病毒的克隆化。应用空斑技术可进行病毒的克隆化。三、病毒鉴定三、病毒鉴定1. 形态学鉴定形态学鉴定细胞病变效

14、应（细胞病变效应（cytopathiccytopathic effect effect，CPECPE）病毒在细胞内增殖后，可引起细胞的不同变化。病毒在细胞内增殖后，可引起细胞的不同变化。常见的形态学改变如细胞圆缩、聚合、溶解或常见的形态学改变如细胞圆缩、聚合、溶解或脱 落 ， 这 些 改 变 称 为 细 胞 病 变 效 应脱 落 ， 这 些 改 变 称 为 细 胞 病 变 效 应（cytopathiccytopathic effect effect，CPECPE）。CPECPE出现的时间也是鉴定病出现的时间也是鉴定病毒的标志之一。毒的标志之一。细胞病变细胞病变正常细胞正常细胞细胞折光性细胞折光

15、性，变圆，局部，变圆，局部全层，死亡脱落，全层，死亡脱落，如：肠道病毒如：肠道病毒细胞聚集成丛，似葡萄串状，细胞间常有细丝细胞聚集成丛，似葡萄串状，细胞间常有细丝状间桥连接，细胞变圆或膨大，如：腺病毒。状间桥连接，细胞变圆或膨大，如：腺病毒。细胞融合现象细胞融合现象 病毒感染后导致感染细胞及相邻细胞细胞膜融病毒感染后导致感染细胞及相邻细胞细胞膜融合的产物，表现为若干细胞的相邻细胞膜消失，合的产物，表现为若干细胞的相邻细胞膜消失，成为多核巨细胞。成为多核巨细胞。 细胞融合现象细胞融合现象 包涵体包涵体定义：定义：是某些病毒感染细胞产生的特征性的是某些病毒感染细胞产生的特征性的形态变化，在普通光学

16、显微镜下可见胞浆或形态变化，在普通光学显微镜下可见胞浆或胞核内出现的呈嗜酸性或嗜碱性染色、大小胞核内出现的呈嗜酸性或嗜碱性染色、大小数量不等的圆形或不规则形的团块状结构，数量不等的圆形或不规则形的团块状结构，称为包涵体。称为包涵体。包涵体的性质包涵体的性质病毒成分的蓄积，如狂犬病毒的病毒成分的蓄积，如狂犬病毒的Negri氏体；氏体；大量晶格样排列的病毒颗粒组成，如腺病毒的大量晶格样排列的病毒颗粒组成，如腺病毒的包涵体；包涵体；细胞变性的产物，不含病毒，如疱疹病毒的包细胞变性的产物，不含病毒，如疱疹病毒的包涵体。涵体。胞浆内有空泡形成，如：猴病毒胞浆内有空泡形成，如：猴病毒SV40SV40、呼肠

17、孤病、呼肠孤病毒等毒等。 感染细胞具有吸附红细胞的能力感染细胞具有吸附红细胞的能力感染细胞的培养液中有许多游离病毒存在，感染细胞的培养液中有许多游离病毒存在，具有凝集红细胞的作用具有凝集红细胞的作用2. 血吸附和血凝作用血吸附和血凝作用多见于以出芽方式释放的病毒。多见于以出芽方式释放的病毒。红细胞吸附红细胞吸附正常细胞正常细胞（1）血吸附作用）血吸附作用吸附试验可通过特异抗血清抑制来达到鉴定具吸附试验可通过特异抗血清抑制来达到鉴定具有吸附特性的病毒。有吸附特性的病毒。（2）血凝作用）血凝作用血凝试验血凝试验血凝抑制试验血凝抑制试验有血凝素（有血凝素（HA）的病毒能凝集）的病毒能凝集人人或动物红

18、细胞，称为血凝现或动物红细胞，称为血凝现象，血凝现象能被相应抗体抑制称为血凝抑制试验，原理是象，血凝现象能被相应抗体抑制称为血凝抑制试验，原理是相应相应抗体抗体与与病毒病毒结合后，阻止病毒表面结合后，阻止病毒表面HA与与红细胞红细胞结合结合. 四、四、 电子显微镜检查电子显微镜检查 病毒的很多特征如大小、形态、结构等病毒的很多特征如大小、形态、结构等必须借助电子显微镜进行检查。对于目前尚必须借助电子显微镜进行检查。对于目前尚难培养而形态又非常典型的病毒，可直接从难培养而形态又非常典型的病毒，可直接从感染组织或分泌液，或者接种病料的鸡胚和感染组织或分泌液，或者接种病料的鸡胚和细胞培养收获的材料作

19、电子显微镜检查，直细胞培养收获的材料作电子显微镜检查，直接观察病毒粒子。接观察病毒粒子。透射电子显微镜透射电子显微镜 1. 正染法：超薄切片法正染法：超薄切片法取材取材固定固定戊二醛戊二醛四氧化锇四氧化锇清洗与清洗与脱水脱水浸透浸透包埋包埋聚合聚合切片切片染色染色铀染铀染铅染铅染鸡痘病毒（超薄切片）鸡痘病毒（超薄切片）超薄切片法的优缺点：超薄切片法的优缺点：优点：可观察病毒形态和形态发生过程优点：可观察病毒形态和形态发生过程缺点：操作复杂，费时，但标本可长时间保存缺点：操作复杂，费时，但标本可长时间保存2.2.负染技术负染技术负染是指通过重金属盐在样品四周的堆积而负染是指通过重金属盐在样品四周

20、的堆积而加强样品外周的电子密度，使样品显示负的加强样品外周的电子密度，使样品显示负的反差，衬托出样品的形态和大小。反差，衬托出样品的形态和大小。铜网铜网样品样品 滤纸滤纸1-2分钟后电镜观察分钟后电镜观察染液染液（常用磷钨酸）（常用磷钨酸）口蹄疫病毒的电镜负染口蹄疫病毒的电镜负染负染法的优缺点：负染法的优缺点：优点：优点：快速简易（快速简易（10-20min）；）；分辨率高；图分辨率高；图象清晰地病毒结构象清晰地病毒结构缺点：缺点：敏感性低，要求病毒量在敏感性低，要求病毒量在10107 7以上；所有样以上；所有样品应处于悬浮状态品应处于悬浮状态免疫电镜技术是将抗原抗体反应的特异性与电免疫电镜技

21、术是将抗原抗体反应的特异性与电子显微镜的高分辨力相结合，在亚细胞和超微子显微镜的高分辨力相结合，在亚细胞和超微结构水平上对抗原物质进行定位分析的一种高结构水平上对抗原物质进行定位分析的一种高度精确、灵敏的方法。度精确、灵敏的方法。 3.3.免疫电镜技术免疫电镜技术(Immune electron microscopy，IEM)（1）免疫凝集电镜技术）免疫凝集电镜技术抗原与抗体凝集反应后，可使标本中病毒抗原与抗体凝集反应后，可使标本中病毒颗粒聚集成团，再经负染直接在电镜下观颗粒聚集成团，再经负染直接在电镜下观察，提高了敏感性，确定病毒的血清学性察，提高了敏感性，确定病毒的血清学性质。质。（2）免

22、疫电镜定位技术）免疫电镜定位技术特异性抗体用电子致密物质，如铁蛋白、过氧化特异性抗体用电子致密物质，如铁蛋白、过氧化物酶等标记后，使之与组织超薄切片中的抗原结物酶等标记后，使之与组织超薄切片中的抗原结合，在电镜下观察到标记物所在位置，即为抗原合，在电镜下观察到标记物所在位置，即为抗原抗体反应的部位。抗体反应的部位。 酶标记染色酶标记染色 五、五、 血清学试验血清学试验 是一种常用的诊断病毒病的方法。可采用是一种常用的诊断病毒病的方法。可采用ELISA、琼脂扩散、中和试验、标记抗体技术琼脂扩散、中和试验、标记抗体技术等免疫血清学方法检查病畜的抗体消长情况和等免疫血清学方法检查病畜的抗体消长情况和发病组织中的病毒抗原。发病组织中的病毒抗原。virus1.1.中和反应中和反应观察特异性抗体能否保护易感的试验动物死亡，观察特异性抗体能否保护易感的试验动物死亡，能否抑制病毒的细胞病变效应。凡能与病毒结能否