630490酵母双杂交文库构建实验流程(clontech)

1、酵母双杂交文库构建基本实验流程第一链cDNA合成1. 准备：高质量的Poly A或总RNA2. 在微量离心管中混匀以下试剂：1 - 2 口 l RNA 样本(0.025 -.0 口 g polj或 0.10 -.0 口 觉、RNA)1.0 口 l CDS III 或 CDSIII/6 引物1 - 2 口 l去离子水(补齐体系到4.0 口 l)4.0 口 l 总体积注意：对照实验时，请使用1 口 l *1 口的对照RNA。CDSIII = Oligo-dT 弓I物CDSIII/6 =随机引物3. 72 C ,孵育 2 min。4. 冰上冷却2 min，然后14000rpm , 10sec,瞬时离

2、心。5. 混合以下试剂，将混合液加入Step4中的经过变性且结合有引物的RNA样本中，轻拍混匀。2.0 口 l 5X First-Strand 缓冲液1.0 口 l DTT (100 mM)1.0 口 l dNTP 混合物(10 mM )1.0 口 l SMART MMLV 反转录酶9.0 口 l总体积6. 只有使用随机引物(CDSHI/6实验才进行此步骤如果采用Oligo-dT (CDSIII请忽略此步骤，直接进行 Step7, 25 C,室温孵育10 min。7. 42，。孵育 10 min。注意：孵育在热盖的PCR仪中进行。若用非热盖的PCR仪或水浴，请在反应管中加入一滴矿物油来避免水分

3、蒸发。8. 加入 1 口SMART III-modified oligo 混匀，42 ,孵育 1 hr。9. 75 C , 10 min终止第一链合成反应。10. 室温冷却，加入1 口RNA酶H (2U)。11.37，。孵育 20 min。12.继续进行 LD-PCR 扩增(Section VII.B。注意：-0C下可保存3个月。第一链反应最终体积为15 口1? 10 卩 l SMART III Oligo(10 卩 M;-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTCATTATGGCCGG)? 10卩l CDS I引物(10 卩 M; 5ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACAI

4、(T)30VN-3 )* 23 个碱基? 10 卩 l CDS III/引 物(10 卩 M;-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGAGAJNNNNN-3)注意：N = A, G, C, or T; V = A, G, or C? 50 卩 l 5 PCR(10 卩 M;-TTCCACCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGG)25 个碱基? 50 卩 l 3 PCR(10 卩 M;-GTATCGATGCCCACCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACA)第二链cDNA合成(LD-PCR尽量使用最小的循环数来得到3-6ug的ds cDNA。Table III中最优的循环数取

5、决于对照小鼠肝脏 RNA的起始量。最优循环数随着模板量、 物种的不同而变化。 这个程序是经过优化适用于 Adva ntage 2聚合酶 混合物(Cat. No. 639201)。使用其他的酶时需要摸索最优循环数 。Table III: RNA起始量与PCR循环数的关系总 RNA （口 g）Poly A+ RNA （ 口 g）循环数(个)1.0 200.5-.015200.5 - .00.25-0.520 t220.25-0.50.125 -.2522 t240.05 -0.250.025-0.12524 t261. 准备：?第一链 cDNA (Section VII.A)?热盖PCR仪2. 建

6、立两管100ul的扩增体系，一个是实验组，另一个是对照组:2 口 l 第一链 cDNA (Section VII.A)70 口 l蒸馏水10 口 l 10X Advantage? 2 PC!缓冲液2 口 I 50X dNTP 混合物2 口 l 5 PC引物2 口 13 PC引物10 口 l 10X溶解液2 口 l 50X Advantage 2聚合酶混合物100 口 l总体积3. 扩增程序:? 95 C30 sec? x Cycles95 C10sec68 Cb6 min? 68 C5mina参考Table III设定PCR循环数。b扩增程序每过一个循环时延伸时间增加5 sec。例如，在第二轮

7、循环中，延伸时间应该是 6min和5sec,如此叠加。4. 对每个样品取 7 口PCR产物，使用0.25 口的1kbladder DNA分子量 标记在1.2%的琼脂糖/ EtBr进行电泳进行分析。注意：如果实验样本没有出现图中所示的结果，请参考疑难解答指南(Section X)o5. 柱纯化(Section VII.C后，可将ds cDNA在 吃0 保存待用。CHROMA SPIN?+TE400 纯化柱纯化 ds cDNA1. 准备：? LDPCR 扩增 ds cDNA （Section VII.B;若没有得到 至少 3 口的勺 ds cDNA, 请使用更多的循环数重新做 LD-PCFT增。）

8、?醋酸钠（3 M）?冰乙醇（95-00%）2. 每93ul的cDNA样品使用一个 CHROMA SPIN TE-400纯化柱（参见 Figure 4）。?颠倒纯化柱数次，重悬胶基质，直至均匀。?移除顶端帽子。?掰断柱底部的break away。?将柱放置在2ml的收集管（已提供）中。注意：构建一个文库需要消耗 2个纯化柱。4. 700 rpm , 5 min离心，丢弃收集管和平衡液，之后让 matrix半干。 注意:推荐使用悬挂转子或水平转子。角转子很可能导致样本从柱的侧面流下，而不是经过胶基质，造成纯化不一致。4. 将将离心柱放在另第二个收集管中，然后，向胶基质平坦的表面上 方加入93ul的

9、样本。注意：切勿让样本从纯化柱内壁流入。5. 700 rpm, 5 min离心，样本便流到了收集管中。6. 将两次的纯化样本收集到一个离心管中，并用乙醇进行沉淀cDNA:?加入1/10体积的3 M醋酸钠。?加入2.5倍体积的冰乙醇 （95 -00%）。?吃0 , 1 hr放置沉淀。? 14,000，室温离心 20 min。?弃上清。? 14,000 rpm瞬时离心，去除残留的上清液。?空气干燥10 min。7. 20 口去离子水重悬cDNA,用于酵母文库构建。(Section VIII).注意：这时候应该可以得到2 - 5(1的 ds cDNA回收效率70%3 / 4酵母双杂交文库构建基本实验

10、流程建立Mate & Plate文库1. 准备：?参考Yeastmaker酵母转化系统2操作步骤制备 Y187感受态细胞。? 20 口 I ds cDNA (Section VIds cDNA 的量在 2 -5 ug。? SD固体培养基(Appendix C)-SD/HLeu 固体培养基 (100 x 150 mm 板)-SD/ -Leu 固体培养基 (5-10 x 100 mm 板)? YPDA/25%甘油(冷冻剂；详见 Appendix C, Section C)注意：卡那霉素硫酸盐应以50ug/ml的浓度加入到酵母培养基中来抑制培养基中细菌污染。(详见 Appendix C, Secti

11、on D)b?无菌的玻璃珠 (5 mm)1. 遵循酵母转化系统2中文库规模酵母转化操作向0.5ml Y187感受态中共转化下列组份? 20 ds cDNA(Section VII) ds cDNA 2- 5 口 g? 6 pGADT7-Rec(0.5口 g/ 口 l)2. 按照转化操作的 Step2,将酵母重悬于 15ml 0.9% (w/v) NaCl中。3. 4.将 100 口 l of 1/10、1/100 稀释液分别铺板于 SD/-_eu 100 mm 固体培养基上，30C,孵育3 Sd;确定文库的库容。4. 参见Section X来提高转化效率。独立克隆数=No. of cfu/ml

12、 on SD/-_eu x重悬液体积(15ml)?这个值标示转化效率?若建立2 x107库容的文库，1/100稀释板上应当133个独立克隆 ?若这时候有1 x107个独立克隆子，那么可以直接进行Step6?若这时候没有1 x107个独立克隆子，请参考 Section X提高转化 效率和cDNA的质量5. 将剩下的悬浮液铺板于 150 mm SD/-_eu选择培养基上。?每板150 口悬浮液，约使用100板? 30 孵育 3-4d6. 收获Step5中的转化子：a. 4C , 3S hr冷却培养板。b. 加入5 ml的冻存液。c. 使用无菌的玻璃珠分离菌落(缓缓地摇晃培养板，玻璃珠均匀地 滚动于培养基表面将分离菌落，分离后的菌落溶于冻融液中)。d. 将所有的液体收集于无菌的单管中。(收集后的体积要达到0.