免试剂离子色谱法检测水产品及其制品中的多聚磷酸盐

1、第4期2011年7月第11卷中国食品学报JournalofChineseInstituteofFoodScienceandTechnologyVol11No4Jul2011免试剂离子色谱法检测水产品及其制品中的多聚磷酸盐王2丽1张丽1励建荣1，2*杭州310035（1浙江工商大学食品与生物工程学院，浙江省食品安全重点实验室渤海大学辽宁锦州121013）摘要利用免试剂离子色谱建立了水产品中常见的正磷酸盐、焦磷酸盐、三聚磷酸盐和三偏磷酸盐的检测方法。该方法使用三氯乙酸作为蛋白质沉淀剂和酶失活剂，样品经匀浆，超声萃取，离心，减压过滤，调pH后，再经OnGuardRP柱除去微量的蛋白质和脂肪，从而保持

2、色谱柱的柱效，延长色谱柱的使用寿命。稀释适当的倍数，经0.20m水系膜过滤器过滤后，进入离子色谱系统，经KOH梯度淋洗，IonPacAG11-HC（4mm×50mm）保护柱，IonPacAS11-HC（4mm×250mm）分离柱分离后，用抑制型电导检测器进行结果检测。此法使4种磷酸盐阴离子在0.1100mg/L范围内均呈现良好的线性，其相关系数均在0.999以上。虾肉中这4种离子的加标回收率在95%103%之间，RSD在1%以内，日内精密度和日间精密度均符合要求，结果令人满意。此法方便、快捷、安全、可靠，其使用范围可扩展到水产制品中，是一种应用范围广、检测迅速、检测成本低廉

3、且环境友好的新型检测方法。利用该方法检测了市售冰冻扇贝、冰冻虾仁及虾丸中各磷酸盐的含量，结果发现多聚磷酸盐的添加现象较普遍，以冷冻虾仁中磷酸盐含量严重超标。本研究可为政府监管部门提供基础数据。关键词文章编号免试剂离子色谱；水产品；多聚磷酸盐；三氯乙酸1009-7848（2011）04-0203-08多聚磷酸盐是应用广泛、用量较大的食品添加剂门类之一。作为重要的食品配料和功能添加剂被广泛应用于各类食品的加工过程中。在水产品中加入多聚磷酸盐可以提高肌肉的保水性，减少水产品在加工、储存和运输过程中水分和营养物质的流失1。然而近年来一些不法商贩利用多聚磷酸盐可以提高水产品保水性这一特点，在水产品中注水

4、，使损害消费者利益的事件屡屡发生2。据报道，自2006年以来，欧盟饲料与食品快速警报系统先后20多次通报从中国输欧水产品中检出多聚磷酸盐超标问题，范围涉及鳕鱼、鲽鱼、石斑鱼、虾仁等多个品种3，大大影响了我国水产品收稿日期：2010-07-20基金项目：国家自然科学基金（30800916）；国家自然科学基金（31071514）；浙江省科技厅海洋生物资源综合加工与利用优先主题项目（2009C03017-5）；国家863计划项目“加工水产品质量与安全控制技术”（2007AA091806）。作者简介：王丽，女，1973年出生，副教授通讯作者：励建荣的出口。摄入磷酸盐过量，对人体有一定危害。短时间内大量

5、摄入可能会导致腹痛与腹泻，长期的影响主要是导致机体的钙磷比失衡，引发相应的疾病4-5。因此，对水产品中的磷酸盐进行检测和监控是非常必要的。传统的磷酸盐检测方法通常是把食品中的多聚磷酸盐转化为正磷酸盐后再进行检测，无法区分多聚磷酸盐的形态，而薄层层析色谱法即使能检测多聚磷酸盐，但方法的灵敏度低，不能准确定量，且繁琐耗时，不能满足现代检测需求。而新的检测方法如离子交换高效液相色谱法（HPLC）、高效毛细管电泳法和核磁共振法等，均因操作过程繁琐、对检测人员的要求较高以及食品基体较复杂6等原因，使方法不能较广泛地应用到食品分析中。而离子色谱法在阴离子检测方面的技术已非常成熟，国内已有用离子色谱检测水产

6、品中多聚磷酸盐的报道7-9，但样品前处理过程较为繁琐，且方法的重现性不高，方法多用于冷冻水产品，在水产品制品中的应用还未见报道，且早期的离子色谱淋洗液需要人工配制，这个过程容易引入CO2，204中国食品学报2011年第4期从而使淋洗液中混入CO32-离子，使背景电导增加，降低了信噪比，仪器的灵敏度没有免试剂离子色谱高。免试剂离子色谱（RFIC）分析技术，其创新之处是淋洗液的在线发生10-11。整个分析试验中，不需要接触任何化学试剂，只需加超纯水，不会有任何化学试剂气雾的暴露，免去配制试剂的人为误差，消除淋洗液吸收CO2生成碳酸盐带来的基线漂移，降低背景电导，提高信噪比，提高检测的灵敏度。同时不

7、会对环境造成任何二次污染，对试验人员无任何化学毒害，是一种环境友好型的检测方法。本文采用免试剂离子色谱技术检测多聚磷酸盐，将试验进一步优化，以期获得更简便快捷、应用范围更广的检测方法，并将此法应用于水产实际样品的检测。12统最低压力1.38MPa，最高压力20.7MPa，流速为1.2mL/min，进样量为25L，柱温30，检测池温度35，淋洗液由美国Dionex公司提供的免试剂发生装置产生，产生的淋洗液为KOH溶液。梯度淋洗的时间及KOH的浓度如表1所示。表1KOH梯度淋洗时间及浓度hydroxidegradienteluentTable1Timeandconcentrationofpotas

8、sium·KOH淋洗浓度/mmolL-1KOH淋洗时间/min041018182130308080303011.1材料与方法试验材料中国对虾，购自杭州市文二街农贸市场；冷冻1.4各磷酸盐阴离子标准溶液的配制根据标准样品的纯度将其折算为纯品后，称扇贝、虾仁、虾丸，购自杭州市文一路物美大卖场。取相应的质量，用0.01mol/L的NaOH溶液溶解并定容，配成阴离子浓度均为1000mg/L的标准溶液，其它各低浓度溶液由此稀释而得。标准溶液转移至PE塑料瓶中，于4冰箱中保存，6个月内使用。1.2仪器与试剂仪器：ICS-1500型离子色谱仪，美国Dionex公司；配电导检测器和循环再生电解抑制器

9、；淋洗液在线发生装置；Chromeleon6.8色谱工作站；0.20m水系膜过滤器；OnGuardRP（1cc）固相萃取小柱，美国Dionex公司；KA组织分散机，德国；高速冷冻离心机（Sigma3K30），德国Sigma公司；SQ2119多功能食品加工机，上海帅佳电子科技有限公司。试剂：磷酸二氢钠、十水焦磷酸钠、三聚磷酸钠、三偏磷酸钠、六偏磷酸钠，均为Sigma公司提供；食品级六偏磷酸钠，宁波散化化工有限公司提供；六偏磷酸钠分析纯，杭州汇普化工有限公司提供；三氯乙酸、三氟乙酸、冰乙酸、甲醇、氢氧化钠，均为分析纯；分析过程中所有实验用水均为经·MILLI-Q纯化的超纯水，其电阻率为1

10、8.2Mcm。1.3色谱条件IonPacAG11-HC（4mm×50mm）保护柱，Ion-PacAS11-HC（4mm×250mm）分离柱，ASRSUL-1.5样品处理方法取23g样品于50mL离心管中，按15（W/V）加入4%的TCA溶液，然后立即用KA组织分散机在17500r/min条件下分散约20s，每次10s，中间停10s，水浴超声10min，然后在4下，5000×g下离心10min，由于多聚磷酸盐与水结合，使常压过滤速度较慢，因此试验中将上层清液用双层滤纸真空抽滤13，沉淀再用超纯水洗涤一次后，同样条件下离心，抽滤，滤液中加2mol/L的NaOH适量，除

11、去脂肪，且使溶液保持在碱性条件（pH>8）下14，转移至100mL容量瓶中定容，过OnGuardRP柱，稀释10倍后，过0.20m水系过滤膜，进离子色谱进行检测。1.6OnGuardRP预柱活化步骤15预柱使用前需按照以下步骤对其活化后方可TRA（4mm）型抑制器，抑制电流为238mA，系处理样品，采用5mL一次性注射器手动活化小第11卷第4期免试剂离子色谱法检测水产品及其制品中的多聚磷酸盐205柱，具体步骤如下：（1）用5mL甲醇活化柱子，推动速度不大于3mL/min；（2）用10mL超纯水冲洗柱子，速度不大于3mL/min；（3）将小柱平放202.2沉淀剂的选择在试验过程中发现4%的

12、3种沉淀剂的蛋白质沉淀效果以三氟乙酸和三氯乙酸较好，乙酸的沉淀效果不佳，离心后上层溶液中加三氯乙酸或三氟乙酸后仍有蛋白质沉淀生成。另外，由图2可见，乙酸和三氟乙酸均在目标离子之前出峰，而三氯乙酸在4种目标阴离子出峰结束后出峰，与目标离子的分离度较高，含量高时亦不会覆盖目标离子峰。同时，三氯乙酸的价格较三氟乙酸低，因此，选择三氯乙酸作为该研究过程中的蛋白质沉淀剂。另外，也有文献报道使用沸水法灭酶三氯甲烷除蛋白，分液后水相进离子色谱进行检测16，但三氯甲烷的毒性较强，对人体危害较大，预试验过程中发现沸水处理鲜虾仁样品后虾肉熟化成团，且比较紧实，肌肉组织不易分散，不利于后续目标物的提取。用三氯乙酸直

13、接处理样品，相对较安全无毒害，价格低廉，且灭酶与除蛋白同时进行，试验结果可靠，收到良好的效果。27242118151296300321ACTFAabcdTCA4min；（4）将5mL样品缓慢推入小柱，弃去前3mL，收集2mL样品微膜过滤后直接进样或者稀释后再经微膜过滤后进样。注意：整个活化过程及样品处理过程中注射器推动速度不能太大，否则预柱填充材料被冲坏，影响预柱除蛋白和脂肪等有机物的效果。1.7结果之间的换算关系样品中如含1g/kgP2O5相当于含0.7g/kgPO43-，0.82g/kgP2O74-，0.84g/kgP3O105-，0.90g/kg（PO3）33-。22.1结果与讨论4种磷

14、酸盐阴离子的离子色谱图从图1可以看出，PO43-、P2O74-、P3O105-、（PO3）33-4种离子的分离效果较好，分离度均大于1.5，各离子的保留时间依次为8.67、11.30、12.42、13.85min。由于聚磷酸根离子长时间在水溶液中特别是法的稳定性，试验中所用标准溶液的pH均保持在碱性范围内。试验使用的分离柱DionexIon-酸性溶液中会发生自身酸水解现象，为了保证方PacAS11-HC（4mm）具有较高的柱容量，同时对氢氧根有着较高的选择性，可以承受高浓度的KOH，有利于多聚磷酸盐的分离。202电导率/S·cm-1电导率/S·cm-136912151821

15、保留时间/min注：a、b、c、d分别为加入三氯乙酸（TCA）、三氟乙酸（TFA）、乙酸（HAC）、不加沉淀剂的20mg/L混合标准溶液的离子色谱图。151105006912151821保留时间/min注：1.PO；2.P2O；3.P3O3-44-75-104图2不同沉淀剂处理后4种磷酸根离子的离子色谱图Fig.2Separationeffectofdifferentprecipitatorson4polyphosphates2.3常见几种级别的六偏磷酸盐的离子色谱图由图3可见，市场上所购买的六偏磷酸钠试剂或食品级添加剂中成分较复杂，没有主峰，Sig-；4.（PO）。3-33ma公司的试剂和国

16、内六偏磷酸钠分析纯及食品级六偏磷酸钠离子色谱峰形较一致，即主要成分较一致，这可能由于环状的六偏磷酸钠不稳定，在溶液中易分解成小分子物质，这与FrederickS.图14种磷酸盐混合标准溶液的离子色谱图ICchromatogramofmixedstandardsolutionof4polyphosphatesFig.1206中国食品学报24211821356电导率/S·cm-12011年第4期电导率/S·cm-13151296300364840322416800369121415182112保留时间/min9151821注：a、b、c、d分别为4种磷酸盐混合标准溶液、Sigm

17、a公司提供的六偏磷酸钠、国产食品级六偏磷酸钠、国产六偏磷酸钠分析纯的离子色谱图。保留时间/min图3常见几种级别的市售六偏磷酸钠的离子色谱图图4市售100mg/L复合磷酸盐的离子色谱图Fig.3ICchromatogramsofdifferentgradescommercialpolyphosphatesFig.4ICchromatogramsof100mg/LcommercialcompoundphosphateStover17等人的研究结果一致，文中他们使用微管离子色谱电导检测器检测到六偏磷酸钠水溶液中存在多种成分的磷酸盐，聚合度从125不等，同时研究还发现六偏磷酸钠溶液在不同的温度下储藏

18、7d后的离子色谱图不尽相同，体现在峰的个数及峰面积上。同时与ElizabethBaluyot18等人的研究结果也较一致，即六偏磷酸钠溶液中存在多种成分，没有主峰。由此可见，很难断定食品中添加六偏磷酸钠后各种性状的变化是由单一的六偏磷酸钠引起的，还是由其它聚合度不等的磷酸盐引起的。另外，试验中还考察了水产品加工中常用的复合磷酸盐的离子色谱行为，如图4所示，结果发表2目标离子线性方程现复合磷酸盐中主要成分是三聚磷酸盐，占95.06%，另外也含有少量的焦磷酸根（3.82%）、磷酸根（0.53%）和三偏磷酸根（0.59%）。2.4方法的线性范围以磷酸盐混合标准溶液进行线性试验，系列质量浓度分别为0.1

19、、0.5、1、5、10、20、40、60、100mg/L。按照上述色谱条件进行测定，每个浓度重复测定2次，以平均值作为计算结果。以各峰的峰面积对相应浓度进行线性回归计算，分别根据3倍基线噪音和10倍基线噪音计算溶液检出限和定量限，结果如表2。4种磷酸盐标准溶液的线性试验结果相关系数（r2）定量限/mg·L-1检出限/mg·L-1Table2ResultsofLineartestabout4phosphatesPO43-P2O74-P3O105（PO3）33-y=0.0816x+0.0032y=0.1014x+0.0011y=0.1058x+0.0121y=0.1049x-0

20、.01670.99980.99980.99990.99990.04640.03670.03410.06170.01390.01100.01020.0185由此可见4种磷酸盐在0.1100mg/L范围内呈现良好的线性，线性相关系数均在0.999以上，跨度在3个数量级。上述前处理方法处理后测定样品中各磷酸盐的含量，然后以提取液为介质，按样品溶液浓度的80%、100%、120%加标，每组样品3个平行，各目标离子的加标回收率如表3所示。2.5加标回收试验以市售鲜活的中国对虾为试验原料，虾肉按第11卷第4期免试剂离子色谱法检测水产品及其制品中的多聚磷酸盐207表3虾仁样品加标回收试验结果（n=9）Tab

21、le3目标离子样品基质/mg·L-1Resultsofrecoveriestestinfreshshelledshrimp（n=9）加标100%/mg·L-1加标120%/mg·L-1平均回收率/%加标80%/mg·L-1RSD/%0.900.480.640.52PO43-P2O74-P3O105-（PO3）33-10.37N.D.N.D.N.D.18.96±0.038.08±0.038.57±0.057.83±0.0521.11±0.0310.18±0.0610.71±0.059.8

22、5±0.0523.11±0.1412.14±0.0412.77±0.0711.85±0.06102.997.5102.894.6由加标回收试验的结果可知，4种标准阴离子的回收率范围在95%103%之间，结果较为满意。阴离子标准溶液各1mL于50mL离心管中，然后按前述样品处理方法进行测定，对照组为10002.6标准品对照试验取1000mg/L的PO43-、P2O74-、P3O105-、（PO3）33-mg/L标准溶液直接定容至100mL，然后离子色谱测定。每组3个平行，试验结果如表4。表4目标离子处理组平均值/mg·L-1标准品对照试

23、验结果处理组与对照组的相对标准偏差（RSD）Table4Resultsofstandardsamplecontrasttest对照组平均值/mg·L-1PO43-P2O74-P3O105-（PO3）33-9.489.509.738.979.659.619.929.231.26%0.81%1.37%2.02%由此可知，处理组与对照组相对标准偏差较小，均在2%以内，满足相关检测的要求。2.8方法的应用将此方法应用到市售冷冻扇贝、冷冻虾仁、冷2.7精密度试验冻虾丸中，样品处理方法如上所述，典型的样品色谱图如图5、图6、图7所示，其中冷冻扇贝中仅检测到正磷酸盐，含量为1.71g/kg，折算成

24、P2O5后的含量为1.28g/kg，而冷冻虾仁中检测到磷酸盐、焦磷酸盐和三聚磷酸盐等3种磷酸盐，且样品中各磷酸根离子的含量分别为3.48、1.92、6.83g/kg，折算成P2O5后其含量为9.92g/kg，冷冻虾丸中4种磷酸盐均检测到，其含量分别为0.49、0.17、0.018、20mg/L的混合标准溶液连续进样5次，PO43-、P2O74-、P3O105-、（PO3）33-的保留时间的日内精密度用RSD表示分别为0.03%、0.05%、0.07%、0.06%，含量的日内精密度分别为0.56%、0.75%、0.76%、0.75%；3d内6次进样的各离子保留时间日间精密度分别为0.08%、0.

25、08%、0.07%、0.09%，含量的日间精密度分别为0.83%、0.85%、0.95%、0.78%；虾肉样品加标80%后保留时间的日内精密度分别为0.03%、0.06%、0.06%、0.07%，含量的日内精密度分别为0.21%、0.08%、0.31%、0.38%，0.011g/kg，折算成P2O5后其含量为0.53g/kg，其中冷冻虾仁中磷酸盐含量远超过了国际规定的含量，水产品及其制品中添加多聚磷酸盐的现象很普遍，特别是冷冻虾仁中磷酸盐的残留量较高，试验中我们检测了3家企业生产的冷冻虾仁均存在磷酸盐超标问题，因此水产品及其制品中磷酸盐安全问题应引起相关部门的关注，并加大监督力度。3天内保留时

26、间的日间精密度分别为0.06%、0.06%、0.06%、0.07%，含量的日间精密度分别为2.23%、3.26%、2.11%、0.88%。以上这些指标均符合相关检测要求。208中国食品学报2011年第4期108电导率/S·cm-12015105039121518213912151821保留时间/min保留时间/min364201电导率/S·cm-112图5市售冷冻扇贝中磷酸盐的离子色谱图图6市售冷冻虾仁中多聚磷酸盐的离子色谱图Fig.5ICchromatogramofphosphateincommercialfrozenscallops108电导率/S·cm-1F

27、ig.6ICchromatogramofphosphatesincommercialfrozenshelledshrimps1642003923124151821保留时间/min图7市售冷冻虾丸中多聚磷酸盐的离子色谱图Fig.7ICchromatogramofphosphatesincommercialfrozenshrimpballs3结论本研究利用免试剂离子色谱建立了水产品中品经微膜过滤后进离子色谱系统进行检测。此法更方便、快捷、安全、可靠，方法的使用范围可扩展到水产制品中，且用虾仁进行的方法学验证结果显示，此法的各个指标均符合检测要求，效果令人满意，是一种应用范围广、检测迅速、检测成本低

28、廉且无污染，对人体无害的一种新型检测方法，可推广至相关企业及各级质检部门。另外，对市售水产品及制品的初步调查结果显示，多聚磷酸盐的添加现象较为普遍，且存在超标现象，应引起各级质检部门及相关企业的高度重视。常见的4种磷酸盐的测定方法，该方法使用三氯乙酸作为蛋白质沉淀剂和酶失活剂，样品经匀浆，超声提取，离心，过滤后，用氢氧化钠调节溶液的酸碱度，使pH在碱性范围内，从而在相对较长时间内保持多聚磷酸盐的稳定性，然后再经OnGuardRP柱除去微量的蛋白质和脂肪，保持色谱柱的柱效和延长色谱柱的使用寿命，随后样参1考文献刘锐萍，裴庆润，张铁军，等.食品中磷酸盐的应用现状及存在问题分析J.综述与述评，200

29、7，10（2）：9-11.第11卷第4期免试剂离子色谱法检测水产品及其制品中的多聚磷酸盐20923456789韩敏义，李巧玲，陈红叶.复合磷酸盐在食品中的应用J.中国食品添加剂，2004，（3）：93-96.EUROP-FoodSafety-FromtheFarmtotheFork：RapidAlertSystemforFoodandFeed（RASFF）DB/OL.2011-7-15.http：/ec.europa.eu/food/food/rapidalert/archive_en.htm.金世鑫.钙磷代谢疾病J.中国骨质疏松杂志，2001，7（4）：346-366.陈凤丽，王涤非.钙磷代

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36、loroaceticacidasaproteinprecipi-tatingreagentandenzymeinactivationreagent，afterhomogenization，ultrasonicextraction，centrifugal，vacuumfiltration，adjustingthepHoftheextractionsolution，whichcouldmaintainthesolutioninalkalinezoneandthestabilityofpolyphosphates，andthenasmallquantityofproteinandfatwererem

37、ovedbyOnGuardRPcolumn，therebykeep-ingthecolumnefficiencyandextendingthelifeofion-exchangecolumn.Afteranappropriatemultipleofdilution，theextractionsolutionthrough0.20mmembranefilters，thefiltratewasinjectedintotheionchromatographysystemtode-terminate：potassiumhydroxidesolutionasthegradienteluent，IonPacAG11-HC（4mm×50mm），IonPacAS11-HC（4mm×250mm），suppressedconductivitydetector.Thismethodshowedabetterlinearinrangeof0.1100mg/L，thecorr