采用重叠延伸PCR获得植物密码子优化的奶牛α干扰素基因

1、采用重叠延伸PCR获得植物密码子优化的奶牛干扰素基因1王雅楠,汪明*中国农业大学动物医学院,北京 (100094E-mail:cauwangyn摘要:根据Genbank中荷斯坦奶牛基因的氨基酸序列,按照紫花苜蓿密码子偏爱性,人工设计并合成了14条寡核苷酸片断,通过重叠延伸PCR并结合定点突变PCR人工合成植物密码子偏爱性的荷斯坦奶牛干扰素基因序列。经克隆测序,证明成功地合成了奶牛干扰素基因。关键词:牛干扰素,重叠延伸PCR,定点突变PCR中图分类号:S81.引言干扰素( Interferon , IFN 是在特定的抗原刺激下由细胞分泌的一类具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节功能等生物活性的糖蛋白。其

2、只能在诱导剂刺激下产生,因而采用基因工程的手段获得干扰素是一个最佳的选择。牛干扰素国内外从80年代开始就展开研究1,已经在多种系统中获得表达2.3,但是尚未有在植物中表达的报道。重叠延伸PCR 技术(gene splicing by overlap extension PCR, gene SOEing, 简称SOE PCR,使用了具有互补末端的引物使PCR产物形成了重叠链,从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸,将不同来源的扩增片段重叠拼接起来,广泛用于构建突变基因、融合基因、长片段基因的合成、基因敲除、基因的体外分子进化和扩增目的基因4。本文采用重叠延伸PCR首先获得了缺失一个碱基的按照紫花

3、苜密码子偏爱性改造后的荷斯坦奶牛干扰素(Bovine Interferon-,BoIFN,再采用SOE PCR诱变,插入了缺失碱基,获得了预期的序列,希望该基因可以在植物中获得高表达量。2.材料和方法2.1 菌株、质粒、工具酶及主要试剂大肠杆菌DH5、载体pGEX6p-1,均由本实验室保存。限制性内切酶购自中晶公司。卡那霉素,氨苄霉素购自欣经科公司。连接酶,PyrobestTM DNA 聚合酶,dNTP等购自宝生物工程有限公司,胶回收纯化试剂盒、质粒抽提试剂盒购自全式金生物技术公司。寡聚核苷酸片段由上海生工生物技术有限公司合成,并经PAGE纯化。基因测序由北京百泰克生物技术有限公司完成。2.2

4、 方法2.2.1 密码子优化采用生物学软件DNAman分析BoIFN基因序列(GenBank序列号为M10952,以CUTG(Codon Usage Tabulated from GenBank,www.kazusa.or.jp/codon所提供的紫花苜蓿1本课题得到2003年度高等学校博士学科点专项科研基金(项目编号20030019019的资助。*通讯作者(Medicago sativa密码子数据库为模版,在保证氨基酸序列不变的情况下,按照紫花苜蓿密码子偏爱性改造编码奶牛干扰素成熟肽的基因序列,该序列长度为498bp,改造后的序列为mHBoIFN-(modified bovine inter

5、feron-。密码子偏倚值(Codon Adaptation Index ,CAI值,曾作为衡量基因密码子改造效果的有效参数(sharp & li 1987。本文中改造后基因的CAI值由在线软件CAI Calculator计算(2.2.2 mHBoIFN-基因序列的合成在mHBoIFN-基因序列5端引入BamH酶切位点以及Kozak序列;3端引入Xhol 酶切位点,并且在终止密码子前面加上内质网固定序列(SEKDEL,加上保护性碱基,序列全长541bp,设计了14条寡聚核苷酸片断,即m1,m2,m3,m4,m5,m6,m7,m8, m9,m10,m11,m12,m13,和m14,寡聚核

6、苷酸的长度为40-60bp之间不等,单数片断为正链,双数片断为负链,正负链之间互补碱基为15-18bp。2.2.3 目的基因的PCR扩增将合成纯化后的寡聚核苷酸m1-m14稀释成50mol/L备用。第一轮 PCR:在两个50L 反应体系中, 分别加入m1-m8,和m9-m14各2L,PyrobestTM DNA 聚合酶0.4L,10 ×Pyrobest Buffer 5 L,2 mmol/L dNTP 4 L 以及H2O各24.6L和28.6L,PCR程序为:945分钟,941分钟,551分钟, 721分钟, 共循环28次后, 于72延伸10分钟。向第一轮PCR产物用1/10体积的3

7、M NaAC 后,再加入总体积3倍的冰冷乙醇混合,-20 30-90分钟,10000g 10分钟,再用75%乙醇洗涤,自然干燥后用20L灭菌去离子水溶解。第二轮PCR:在两个50L反应体系中, 加入第一轮PCR浓缩产物各1L作为模版, 前者以m1和m8作为上下游引物,后者以m9和m14作为上下游引物,每个引物加入0.8L,其余同前,加水补足。PCR程序为:945分钟,94 30秒,57 40秒, 72 40秒, 共循环29次后, 于72延伸10分钟。将产物命名为M1和M2。第三轮PCR:在50L反应体系中, 加入第二轮PCR产物各2L作为模板,m1和m14作为上下游引物,其余同前,加水补足。P

8、CR反应程序:945分钟, 941分钟,551分钟, 721分钟, 共循环28次后, 于72延伸10分钟。得到M3。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。 图1:重叠延伸PCR扩增重组BoIFN图示2.2.4 重组质粒的构建用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收第三轮PCR产物,采用BamH和Xhol 双酶切M3和载体pGEM 6p-1,经琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收双酶切产物后,采用T4连接酶于16反应过夜进行连接后, 即为重组质粒pGEMmHBoIFN-。2.2.5 重组质粒转化DH5感受态宿主菌采用CaCl2 法常规制备DH5感受态宿主菌,与10L连接产物在冰水中共浴30 min, 再于4

9、2水浴中休克90 s, 加入不含氨苄青青霉素的LB 培养基900 L, 置37 45 -60min。以5 000 r/min离心3 min, 弃上清, 留取约100 L 残液, 均匀涂布于含100 mg/L 氨苄青霉素的LB平板上, 于37培养过夜。2.2.6 重组质粒pGEMmHBoIFN-的筛选和鉴定从平板上随机挑选几个白色菌落, 接种于含3 mL氨苄青霉素的LB培养基中, 于37以200 r/min振荡过夜。取1L菌液作为模版,m1和m14作为引物,进行菌液PCR鉴定。PCR的循环条件同第三轮PCR。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。离心收集菌液PCR阳性的菌液,提取质粒pGEMm

10、HBoIFN-,采用BamH和Xhol 双酶切进行双酶切鉴定。酶切产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。双酶切阳性的菌液送到北京百泰克生物技术有限公司进行测序。2.2.7 定点突变PCR由以上步骤获得的核苷酸序列M3与预期的mHBoIFN-序列相比在第162位碱基处缺失了一个胞嘧啶(C,再次采用重叠延伸法进行特异性诱变。第一轮 PCR:在两个25L 反应体系中, 分别加入m1/m4,和m5/m14最为上/下引物各0.5L,M3作为模板1L,Pfu DNA 聚合酶0.2L,10 ×Buffer 2.5 L,2 mmol/L dNTP 2L,其余加水补足。PCR程序为:945分钟,94 40

11、秒,501分钟, 721分钟, 共循环28次后, 于72延伸10分钟。第二轮PCR,在50L 反应体系中, 以上一轮两个体系中得到的产物作为模板,各1L(模板共2L, m1/m14作为上/下引物各0.8L,Pfu DNA 聚合酶0.5L, 10 ×Buffer 5 L,2 mmol/L dNTP 4L,其余加水补足。PCR程序为:945分钟,94 40秒,501分钟, 721分钟,循环7次后,再94 40秒,571分钟, 721分钟,循环14次,最后72延伸10分钟。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。重复1.2.4-1.2.6步骤。 图2:定点突变PCR图示3.结果分析3.1

12、BoIFN基因改造结果CAI值是指依据某个物种的“所有”基因的密码子偏倚性,衡量一个基因在这种物种中是否可以高效表达,具有低密码子偏倚值的基因倾向于低水平表达,无论根据mRNA 表达或蛋白质水平的分析都是如此。当基因的密码子偏倚值为0.25或更低时(如大多数基因, mRNA水平与蛋白质水平的相关性很差。对大多数高表达的基因(密码子偏倚值>0.5的基因,mRNA水平与蛋白质水平的相关性要高很多5.6。BoIFN-序列按照以上原则改造之后,采用软件DNAman分析mHBoIFN-序列的GC含量由58.8%下降到43.8%,后者更接近现有苜蓿基因的GC含量值(43.74%,采用CAI Calc

13、ulator计算CAI值,结果由0.553上升到0.827。3.2 寡聚核苷酸设计表1 14条重叠延伸PCR寡聚核苷酸引物序号 5-3方向m1 CGCggatccAGAACCATGGACTGTCATCTTCCTCACACTCATTCTCTGGCTAACCm2 CATTCTCTGGCTAACCGTAGAGTTTTGATGCTCCTTCAGCAATTGAGAAGGG TTTCACCm3 GAGAAGGGTTTCACCTTCTTCATGTCTTCAGGACAGGAACGATTTCGm4 GACAGGAACGATTTCGAATTTCTTCAAGAAGCTCTGGGTGGATCACAGTTGC AGAm

14、5 GGATCACAGTTGCAGAAAGCTCAAGCAATTTCTGTTCTTCACGAAGTGACTC AGCm6 CACGAAGTGACTCAGCATACCTTTCAATTGTTTAGTACAGAAGGTTCTCCAG CTACm7 AGAAGGTTCTCCAGCTACTTGGGATAAGTCACTCCTTGATAAGTTGCGTGCT GCCTTm8 AAGTTGCGTGCTGCCTTGGATCAACAGCTTACTGATTTGCAAGCATGTCTTA CACAGGm9 GCATGTCTTACACAGGAAGAGGGATTGCGTGGTGCTCCACTTTTGAAGGAGGm10

15、CCACTTTTGAAGGAGGATTCATCTCTTGCTGTTAGGAAGTACTTCCATAGAC m11 GGAAGTACTTCCATAGACTTACTCTCTATCTGCAAGAGAAGAGACATTCTCC ATGTGCm12 GACATTCTCC ATGTGCTTGG GAAGTTGTGA GAGCAGAAGTCATGAGAGCA TTCAGm13 GTCATGAGAGCATTCAGTTCTTCAACAAACTTGCAAGAGAGTTTCAGGAGAA AGGACm14 TTCAGGAGAA AGGACTCTGA GAAGGATGAA CTTTAActcgagCGG 注:小写字母

16、代表酶切位点;斜体字母代表内质网固定序列SEKDEL;斜体并且含有下划线的序列表示Kozak序列;粗体并且含有下划线的字母代表相邻序列重复序列。3.3 三轮重叠延伸PCR扩增结果经第一轮SOE PCR获得了多个长约100-250bp的片段(见图1;第二轮SOE PCR分别采用前一轮中的产物做模版,m1/m8和m9/m14做上/下游引物,获得了长约300pb(具体应当为328bp和250pb(具体应为237bp的片段,第三轮 SOE PCR将第二轮两个体系中的PCR产物作为模版,采用m1/m14作为上/下游引物扩增获得了预期长度大小的M3,长度为大于500pb(见图2。 3.4 定点突变PCRM

17、3为模版,m1/m14分别作为上下游引物,m4/m5分别作为突变引物,经过第一轮PCR,获得了两条长度分别为169bp和396bp的片段(图3,两轮PCR之后,获得了长度为550bp 左右的产物(图4,经过Bam H和Xhol双酶切后,插入到载体pGEX-6p1的多克隆位点,获得了重组质粒pGEX-BoIFN。经过连接转化,取阳性克隆作菌液PCR,鉴定阳性者 3.5 测序结果 14 条寡聚核苷酸经过 3 轮重叠 PCR 得到的产物 M3 在 162 位（图 4 中的 199 位）碱基 处缺失了一个胞嘧啶（C），经过采用 4 个引物两轮 PCR 后缺失的碱基被正确插入，见图 5 的 193 位。

18、 -6- 图 4：M3 测序结果。 图 5 突变 PCR 扩增结果。 4讨论 本文通过重叠延伸 PCR 扩增得到了按照紫花苜蓿密码子偏爱性改造的荷斯坦奶牛 干 扰素基因。自 1989 年 Horton 等7成功建立了重叠延伸 PCR(gene splicing by overlap extension ：SOE-PCR 技术以来，使得长链 DNA 的人工合成变为可能，该技术已经广泛应用于 分子生物学领域的研究3.8-10。本文设计了 14 条长度在 40-60bp 之间的寡聚核苷酸，相邻每 条核苷酸的重叠区域在 15-20bp 之间， 含量在 45-50%。 GC 虽然在反应中采用了高保真的酶

19、， 但是在调取的 3 个阳性克隆中， 只有一个同目的基因片断最为接近， 即在 162 位缺失了一个 碱基。随后又采用重叠延伸 PCR 的定点突变技术，获得了目的基因。定点诱变有寡核苷酸 介导的定点诱变、盒式诱变和以 PCR 为基础的定点诱变。PCR 为基础的定点诱变回收率高, 并且快速、简便、准确 ,简单易行。PCR 定点诱变包括重叠延伸 PCR 法和大引物 PCR 法。 本文中采用的是前者，即需要 4 个引物,其中,包括 2 个含有突变碱基的反向互补的引物,2 个 上下游通用引物，通过两轮 PCR，总共 3 个反应，第一轮两个反应可以分别得到含有突变 位点的目的基因上下游片断， 第二轮反应通

20、过突变引物的互补性而互相延伸得到含有突变位 点的目的基因。本文巧妙的将含有发生突变位点的 2 个寡居核苷酸片断 m4 和 m5 分别作为 突变引物 1 和 2， 将寡居核苷酸片断 m1 和 m14 作为上下游通用引物， 常规的定点突变 PCR 中，在第一轮结束后，需要纯化产物，在将第一轮产物作为模板进行第二轮的扩增11，但 是本实验中，作者发现第一轮产物不需纯化直接作为第二轮的模板也可以得到满意的结果。 已有很多研究表明， 密码子使用是有物种特异的， 高表达基因偏爱使用的密码子与丰度 最高的同受体 tRNA 丰度相对应12。 本文希望获得的按照紫花苜蓿密码子偏爱性改造的奶牛 干扰素基因可以在紫

21、花苜蓿反应器中有较高的表达量。 -7- 参考文献 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Velan, B., et al., Bovine interferon alpha genes. Structure and expressionJ. Journal of Biology Chemistry. 260: 5498-5504, 9.1985 Gentilomi, G., et al., Expression of bioactive recombinant bovine interferon-gamma using baculovirusJ. New Microbiolog

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