骨髓间充质干细胞分离培养和生物学特性的研究进展

1、骨髓间充质干细胞分离培养和生物学特性的研究进展邴爱英 宋文刚(泰山医学院 , 山东 泰安 271016关键词 :骨髓间充质干细胞 ; 分离培养 ; 生物学特性中图分类号 :R392文献标识码 :A 文章编号 :1004-7115(2011 07-0549-04骨髓间充质干细胞 (bone marrow mesenchymal stem cells , BMSCs 亦称骨髓基质干细胞 (bone mar-row stromal cells , BMSCs , 是主要存在于机体骨髓 腔中的一种干细胞 , 在一定的诱导条件下 , 可分化 为多种胚层细胞 12, 更重要的是骨髓间充质干细 胞具有较强的

2、免疫调节功能 , 进行异体移植时可避 免免疫排斥反应 3, 故对骨髓间充质干细胞的研究 越来越受到广泛的关注 。20世纪 70年代中期 , Friedenstein 等首次报道 , 骨髓标本中小部分贴壁细胞在培养过程中能够分化 形成类似骨 、 软骨的集落 , 并将之称为骨髓多能间充 质干 细 胞 (marrow pluripotent stromal cells , 又 称 BMSCs 。 1997年 , Prockop 成功分离出 BMSCs , 发现 其具有多向分化潜能 , 可分化为成骨细胞 、 软骨细 胞 、 脂肪细胞 、 神经样细胞和成肌细胞等 。 近年来 , 人们在研究中建立了人 、

3、 猴 、 兔 、 大鼠等不同种属 BMSCs 的培养体系 , 其取材部位及方式等各有不 同 。1骨髓间充质干细胞的分离与培养BMSCS 的 含 量 很 低 , 约 占 骨 髓 有 核 细 胞 的 0. 001% 0. 010%左右 , 并且随着年龄增长递减 , 要 利用 BMSCS 就必须实现 BMSCS 的体外分离培养和 扩增 。 目前对骨髓间充质干细胞的分离 、 纯化 、 培养 还没有统一的方法 , 现在较为常用的分离方法主要 有 :贴壁筛选法 、 密度梯度离心法 、 流式细胞仪和免 疫磁珠分离法 。 前两种方法获得的骨髓间充质干细 胞成分复杂 , 纯度不够高 。 而用流式细胞仪和免疫 磁

4、珠分离技术虽然可获得高纯度的骨髓间充质干细 胞 , 但对细胞活性和分化能力有较大影响 , 而且实验 条件要求高 , 需要骨髓量较大 。 目前最常用的是贴 壁筛选法与密度梯度离心法相结合的方法 , 既可以 增加分离 BMSCs 的纯度 , 又避免影响 BMSCs 的活 性 , 而且操作简便 , 成本不高 4。11贴壁筛选法 贴壁筛选法是骨髓间充质干细 胞最初的分离培养方法 , 是由 Friedenstein 在 19世 纪 70年代中期建立的 。 它是根据 BMSCs 在塑料培 养瓶中贴壁生长的特性 , 通过定期换液除去不贴壁 细胞 , 从而达到分离 、 纯化 BMSCs 的目的 。 Fried

5、en-stein 等的工作创建了一种体外分离和培养的简便 可行的方法 。 至今该方法仍是一种得到广泛应用的 经典途径 。12密度梯度离心法 梯度离心法的核心主要是 基于密度梯度离心技术 。 梯度离心法是根据骨髓中 细胞成分的比重不同 , 使用淋巴细胞分离液提取单 个核细胞 , 再进行贴壁培养 , 从而达到分离 、 纯化 BMSCs 的目的 。 Pittenger 等的研究发现通过密度梯 度离心分离培养的间充质干细胞在第一代时纯度可 以达到 95%。13流式细胞仪和免疫磁珠法 常用方法为免疫 磁珠法 , 是利用免疫学的技术分离 BMSCS , 分离细 945泰 山 医 学 院 学 报JOURNA

6、L OF TAISHAN MEDICAL COLLEGE Vol. 32No. 72011*基金项目 :国 家 自 然 科 学 基 金 项 目 (30872322 。 山 东 省 自 然 科 学 基 金 项 目 (2009ZRB01841 。 泰 山 医 学 院 科 研 计 划 课 题 (20092RQN019 。作者简介 :邴爱英 (1977 , 女 , 山东即墨人 , 讲师 , 硕士 , 主要从事医学免疫学实验教学和研究工作 。胞的纯度高 。 Phinney 5用一种免疫耗损技术精确 地将造血细胞系和内皮细胞系从基质细胞中分离出 来 , 提供了一种能高效的分离纯化间充质干细胞的 方法 ,

7、但目前仍未筛选到真正特异性的细胞表面标 记 ; 而且 , 这两种分离方法的操作对细胞活性都有较 大影响 , 造成 BMSCS 损伤 , 出现增殖缓慢等问题 , 这 些技术问题很大程度上限制了这两种方法的应用 。 因此 , 如何能简便高效地获得均质性的间充质干细 胞和细胞群仍需要继续探索 。14BMSCs 的培养 、 扩增 最常用的是 LG-DMEM 培养基 , 含体积分数 10% 20%的胎牛血清 , 其中 体积分数 10%的胎牛血清最有利于 BMSCs 的贴 壁 、 扩增及多系潜能的维持 , 体积分数过高时 , 血清 中含有大量促进细胞增殖分化的因子 , 容易使细胞 过早出现老化 。 但如果

8、 BMSCS 要应用于临床治疗 , 则 BMSCS 应尽量避免和胎牛血清或新生牛血清的 接触 , 以避免污染疯牛病毒和异体蛋白增加的过敏 风险 。 目前已有多项研究使用脐带血血清或人自体 血清替代胎牛血清用于 BMSCs 的培养 , 这样既可以 避免上述风险 , 又因此类血清中含多种细胞因子 , 可 促进 BMSCs 的增殖 、 分化 , 因此为临床提供了一种 安全有效的培养方法 。 此外 , 种植密度 、 氧体积分数 及细胞因子都对 BMSCs 的培养有一定影响 , Lennon 等认为低密度种植有益于细胞扩增 , 氧体积分数低 于 20%有利于干细胞功能的存留 , 血小板衍生生长 因子 、

9、 碱性成纤维细胞生长因子亦有较强的促进增 殖作用 。2骨髓间充质干细胞的生物学特性骨髓基质是骨髓腔中为造血干细胞提供结构和 功能支持的结缔组织 , 由基质细胞和细胞间基质构 成 。 BMSCS 主要有如下特性 : 形态学特征 ; 具 有自我复制 、 增殖能力 ; 间充质干细胞的表面抗原 标记 ; 具有多向分化的能力 。21骨髓间充质干细胞的形态学特征体外培养的 BMSCS 体积小 , 成梭形或多角形 , 核浆比大 , 多为平行排列生长或漩涡状生长 , 部分贴 壁细胞可以快速形成集落 , 一些呈典型的纺锤形样 的 BMSCS 增殖迅速 , 形态均一 。 细胞传代后 , 传代 细胞较原代细胞的贴壁

10、速度快 , 细胞传到第 3代时 , 细胞形态比较一致 。在光镜和相差显微镜下 , BMSCS 为长梭形 , 类 似成纤维细胞外观 。 透射电镜下 BMSCS 可表现为 两种不同的形态结构类型 :一种是处于相对静息状 态的细胞 , 核较大 , 核质比大 , 胞质内细胞器少 ; 另一 种是处于相对活跃期细胞 , 细胞体积大于前者 , 核不 规则 , 含 2 3个核仁 , 核质比小 , 胞质中有丰富的细 胞器 。22骨髓间充质干细胞自我复制 、 增殖能力BMSCS 在体外培养条件下生长与其它细胞一 样 , 经历生长滞缓期 、 对数增殖期和生长平台期 。 对 细胞周期的研究显示 , 只有 10%的 B

11、MSCS 复制活 跃 , 而大多数细胞处于 G/G1期 , 高比例的 G 0/G 1期细胞暗示 BMSCS 具有高度的分化潜能 6。 BM-SCS 能在体外多次传代仍保留其染色体核型和端粒 酶活性 。 Conget 等对培养条件下 BMSCS 的生长增 殖进行了实验 , 发现成体 BMSCS 可以在体外分裂 (38 4 次 , 并且保持纺锤形态和成骨潜能直至细 胞衰竭 。 细胞进行冷冻复苏后培养可传代达 15次 , 细胞的增殖分化潜能未受影响 。 作为组织工程种子 细胞 , 必须携带正常且完整的遗传信息 , 多次传代后 这些遗传信息没有改变 。23骨髓间充质干细胞的表面标记与造血干细胞不同 ,

12、 BMSCS 的表面抗原并没有 确定 。 已有数个抗体被用来鉴定 BMSCS , Stro-1阳 性细胞具有多向分化能力 , 但是 Hung 等的研究提 示体外扩增的 Stro-1阴性的骨髓间充质干细胞同样 具有多向分化能力 。 单克隆抗体 SH2和 SH3被认 为是对人 BMSCS 比较特异的标记 , SH2抗体认为是 对应于细胞表面的 CD105抗原决定簇 , SH3抗体对 应于 CD73。 但是在 Lee 研究中 , 分离获得的 BMSCS 具有典型的自我增殖和多向分化特性 , 但 CD105标 记都为阴性 。 至今仍没有特异的标记物来鉴定 BM-SCS 类细胞 , 比较一致的看法是 ,

13、 对于所分离的 BM-SCS 进行其表面抗原检测的意义 , 仅仅在于判断所 获得的细胞的纯度或均一性 , 或是初步判断其为不 同于骨髓造血干细胞的一类细胞 , 即骨髓间充质干 细胞 7。24骨髓间充质干细胞的多向分化大量的体内外实验证明 , BMSCS 具有多向分化055泰 山 医 学 院 学 报 JOURNAL OF TAISHAN MEDICAL COLLEGE Vol. 32No. 72011潜能 , 在不同的微环境下可向不同的组织细胞分化 。 比如 , 在培养基中加入适量的 DXM 、 -甘油磷酸钠 、 抗坏血酸可诱导 BMSCS 向成骨细胞分化 8; 而加入 适量的 DXM 、 人胰

14、岛素 、 1-甲基 -3-异丁基黄嘌呤 、 消 炎痛等可诱导 BMSCS 向脂肪细胞分化 9; 另外 , 在 特定的微环境下尚可诱导 BMSCS 向成软骨细胞 、 平 滑肌细胞 、 星形胶质细胞 、 神经细胞 、 肝细胞 、 血管 内皮细 胞 和 心 肌 细 胞 等 三 个 胚 层 的 组 织 细 胞 分 化 1012。 但是诱导分化出的细胞在体内是否能有 效的归巢到特定部位 , 并发挥有效的生理功能尚待 更多的证据进一步研究 。3骨髓间充质干细胞的鉴定BMSCs 的鉴定问题是目前的难点之一 , 其原因 主要在于对 BMSCs 的特异性表面标记物仍存在争 议 。 在体外 BMSCs 以易于贴附

15、于塑料培养板为特 征 , 未分化的基质细胞呈梭形或成纤维细胞形 。 通 常采用其特征性的形态以及分化为其它基质细胞系 的功能来鉴定 。国际间充质及组织干细胞委员会于 2006年对 人来源 MSCs 实验研究提出三条最低鉴定标准 13: 在标准培养条件下 , MSCs 必须具备对塑料底物的 贴附特性 ; 通过流式细胞仪检测 , MSCs 群体表达 CD105、 CD73及 CD90阳 性 率 95%, 且 CD45、 CD34、 CD14或 CD11b 、 CD79a 或 CD19、 HLA-DR 阳 性率表达 2%; 经体外诱导 , MSCs 必须能向成 骨细胞 、 脂肪细胞及软骨细胞分化 。

16、 比较公认的鉴 定标 志 是 BMSCs 既 不 表 达 造 血 细 胞 表 面 抗 原 CD34、 CD45、 CD14、 CD38, 也不表达淋巴细胞表面 抗原 CD11a 、 CD11b , 但表达许多粘 附 分 子 CD44、 CD166、 CD29等 , 同时表达一些基质细胞表面抗原 CD105(SH2 、 CD73(SH3、 SH4 以及一些细胞因子 受体 IL-1R 、 IFN-R 、 TNF-, BMSCs 表达 HLA- 类 抗原 , 基本不表达 HLA- 类 抗 原 1417。 SH2和 SH3为 BMSCs 相对特异性抗原 , 但其单抗来源困 难 , 尚不能作为 BMSC

17、s 常规检测指标 。 目前鉴定 BMSCs 主要依赖其形态及功能特征 。4应用前景骨髓间充质干细胞是一类独特的干细胞 , 具有 非常强的自我增殖能力和分化的多潜能性 , 可以被 诱导分化成各种间充质组织 , 包括骨 、 软骨 、 肌肉 、 神 经 、 血管内皮等细胞 。 由于其多向分化的潜能 , 兼有 易于获得 , 对机体损伤小及体外扩增能力强的特点 , BMSCs 是组织工程理想的种子细胞 , 具有广阔的应 用前景 1820。 骨髓间充质干细胞体外培养系统的 建立有利于进一步研究其移植及分化机制 , 具有良 好的应用前景 。体外培养的 BMSCs 具有多向分化潜能 , 如成骨 细胞 、 软骨

18、细胞 、 心肌细胞 、 骨骼肌细胞 、 神经细胞 等 , 把 BMSCs 植入体内不同组织内 , 可分化出多种 不同组织细胞 , 表现出相应组织细胞的表型和功能 , 具有治疗相应组织脏器疾病潜在价值 。 诸多研究证 实其在治疗骨软骨缺损 、 心脏疾病 、 血管疾病 、 神经 系统疾病等方面具有重要应用价值 , 是目前研究最 广泛的细胞之一 2123。5存在的问题目前对骨髓间充质干细胞的认识和了解还在初 步阶段 , 很多实验也表明间充质干细胞具有其它细 胞难以比拟的优点 , 因此人们已迫不及待地把这些 细胞运用于心血管疾病 、 血液系统疾病 、 神经系统疾 病及外科损伤等领域的治疗 。 但是在许

19、多具体应用 过程中还有很多问题有待研究 , 例如 : 寻找和鉴定 BMSCs 所特有的细胞表面标志分子 。 对间充质 干细胞本身特性的研究 , 包括它的真正起源 、 如何能 够快速获得纯的间充质干细胞等 , 尚需进一步研究 。 体外诱导间充质干细胞多向分化效率不高 。 间 充质干细胞的相互作用 , 如间充质干细胞与造血干 细胞间相互作用 、 间充质干细胞与不同成熟阶段的 细胞相互作用直接对其生长 、 分化产生的影响等 , 都 需要进行更深一步的研究和探索 。参考文献 :1Dezawa MSystematic neuronal and muscle induction systems in bo

20、ne marrow stromal cells :the potential for tissue reconstruction in neurodegenerative and muscle degenerative diseases J Med Mol Morphol , 2008, 41(1 :14-192Ladage D , Brixius K , Steingen C , et alMesenchymal stem cells in duce endothelial activation via paracine mechanisms J Endo-thelium , 2007, 1

21、4(2 :53-63155泰 山 医 学 院 学 报JOURNAL OF TAISHAN MEDICAL COLLEGE Vol. 32No. 720113Le Blanc K , Ringden OImmunomodulation by mesenchymal stem cells and clinical experience J Intem Med , 2007, 262(5 : 509-5254Aslan H , Sheyn D , Gazit DGenetically engineered mesenchymal stem cells :applications in spine t

22、herapy J Regen Med , 2009, 4(1 :99-1085Phinney DGIsolation of mesenchymal stem cells from murine bone marrow by immunodepletion J Methods Mol Biol , 2008, 449:171-1866Sudo K , Kanno M , Miharada K , et alMesenchymal progenitors a-ble to differentiate into osteogenic , chondrogenic , and /oradipo-gen

23、ic cells in vitro are present in most primary fibroblast like cell populations J Stem Cells , 2007, 25(7 :1610-16177Dvorakova J , Hruba A , Velebny V , et alIsolation and character-ization of mesenchymal stem cell population entrapped in bone marrow collection sets J Cell Biol Int , 2008, 32(9 :1116

24、-11258Mohr S , Portmann Lanz CB , Schoeberlein A , et alGeneration of an osteogenic graft from human placenta and placenta derived mesenchymal stem cells J Reprod Sci , 2010, 17(11 :1006-10159Vidal MA , Kilroy GE , Lopez MJ , et alCharaterization of equine adipose tissue derived stromal cells :adipo

25、genic and osteogenic capacity and comparision with bone marrow derived Mesenchy-mal Progenitor Cells J Vet Surg , 2007, 36(7 :613-62210Shahdadfara A , Fransdala K , Hnug T , et a1In vitro expansion of human mesenchymal stem cells choice of serum is ad etermi-nant of cell proliferation , differentiat

26、ion , gene expression , and transcriptome stability J Stem Cells , 2005, 23(9 :1357-136611Krampera M , Marconi S , Pasini A , et a1Induction of neural like differentiation in human mesenchymal stemcells derived from bone marrow , fat , spleen and thymus J Bone , 2007, 40(2 : 382-39012Ni WF , Yin LH

27、, Lu J , et alIn vitro neural differentiation of bone marrow stromal cells induced by cocultured olfactory en-sheathing cells J Neurosci Lett , 2010, 475(2 :99-103 13Dominici M , Le Blanc K Mueller I , et alMinimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cellsThe International Society

28、for Cellular Therapy position statement J Cytotherapy , 2007, 9(3 :301-30214Anokhina EB , Buravkova LBHeterogeneity of stromal precursor cells isolated from rat bone marrow J Tsitologiia , 2007, 49 (1 :40-4715Jackson L , Jones DR , Scotting P , et a1Adult mesenchymal stem cells :Differentiation pote

29、ntial and therapeutic applications J Postqrad Med , 2007, 53(2 :121-12716Abdallah BM , Kassem MHuman mesenchymal stem cells from basic biology to clinical applications J Gene Ther , 2008, 15 (2 :109-11617Delorme B , Charbord PCulture and characterization of human bone marrow mesenchymal stem cells J Methods Mol Med , 2007, 140(1 :678118Garcia-Castro J , Trigueros C , Madrenas J , et alMesenchym