HPLC方法及原理

1、High Performance Liquid Chromatography(HPLC)2006 05 23HPLC的分类HPLC系统HPLC理论公式HPLC方法开发HPLC的定性定量分析高效液相色谱 早期的液相色谱是采用直径为1-5cm，长度50-500cm的玻璃柱进行的 早期液相色谱的柱流速很低，导致了长分析时间。 在90年代后，由于采用了高压输液系统及高效的色谱柱，使得液相技术得到了很大的发展。 HPCL是高效液相色谱的英文缩写。 HPLC的应用 能被用来进行物质的准确定量分析。 适合分离非挥发性物质。 能分析热不稳定性物质。 通常HPLC能分析的物质有： Amino acids 氨基酸

2、 Proteins 蛋白质 Nucleic acids 核酸 Hydrocarbons 碳氢化合物 Carbohydrates 糖类 Drugs 药物 Terpenoids 类萜烯 Pesticides 杀虫剂 Antibiotics 抗生素 Steroids 类固醇 Metal-organic species 金属有机物 A variety of inorganic substances. 各种无机化合物HPLC的分类吸附色谱 adsorption chromatography分配色谱 partition chromatography离子色谱 ion chromatography分子排阻色谱

3、 size exclusion chromatography亲和色谱 affinity chromatography吸附色谱的分离机理 随着样品在固定相上的吸附能力由大到小 在色谱柱上的保留由长到短分配色谱的分离机理 色谱的固定相极性表面 O O O | | |OSiOSiOSiOH | | | O O O | | |OSiOSiOSiOH | | | O O Obulk (SiO2)x surface 非极性表面硅胶 O O O | | |OSiOSiOSiOR | | | O O O | | |OSiOSiOSiOR | | | O O Obulk (SiO2)x surface衍生后的硅

4、胶此处 R = C18H37“normal phase”“反相”Normal vs. Reversed Phase Chromatography Temporal course 分子排阻色谱的分离机理 可以分为可以分为 凝胶过滤凝胶过滤 (gel filtration) 凝胶渗透凝胶渗透 (gel permeation)Gel Filtration Chromatography:流动流动相：为一般水溶液相：为一般水溶液固定相：为软质胶体，固定相：为软质胶体，Agarose (sepharose)Dextran (sephadex) PolyacrylamideGel Permeation Ch

5、romatography:流动流动相：为一般有机溶剂相：为一般有机溶剂固定相：为硬质胶体，固定相：为硬质胶体，Cross-linked polystyreneAlkylate dextranControlled-porosity glass beads.分子排阻色谱SEC的校正曲线 分子量大于V0或小于Vt的分子不能分离典型的HPLC系统后续样品处理检测器(UV, MS, Scnt)组分收集器废弃流动相储液瓶泵 B进样器进样器定量环Sample LoopTime色谱柱(Stationary Phase)泵 A梯度混合器往复泵 检测器的种类通用型示差折光 Refractive Index (RI

6、) detectors蒸发光散射 Evaporative Light Scattering detectors特殊型紫外可见光 Ultraviolet-visible light detectors (UV-Vis)荧光检测器 Fluorescent detectors 电化学检测器 Electrochemical detectors 电导检测器 Conductivity detectors示差检测器蒸发光散射检测器紫外可见检测器A = e ebcRetention time:k =K VSVMK =k VMVSK =cScMa a =(tR )B - tM(tR )A - tMk = (tR

7、 - tM)/tMa a =kBkA=KBKARS =2(tR )B - (tR )A WA + WBRS = N4a a( ( a a 1) 1)(1 + (1 + kB ) )kB2BB22S k k11RN + + a aa aH = L/N2R2t16LW H ( () )3BB22SBR k k11uHR16t + + a aa a22/1RWt 5.54 N 2RWt16 N Partition coefficient:Column capacity factor:Selectivity factor:Resolution:Number of plates:Plate height

8、:HPLC的理论公式主要参数, VR 保留体积, 与柱类型有关。 Vo 是死体积, 柱中液相的体积。 k 是容量因子。 HPLC 的保留参数kVVVRooRetention time * flow rate (ml/min) = VR死体积Vo, 死体积是色谱柱中液相的体积简单规律是简单规律是: Column dead volume = 65% of the volume of empty column465. 020LDV 容量因子a= tR(B) /tR(A) = KR(B) /KR(A)选择性因子柱效参数VAN DEEMTER 方程HETP = H = A + B/ + C A - Mu

9、ltipath effect (Eddy diffusion) B/ - Longitudinal diffusion C - Mass transfer term多路效应 (涡流扩散)INITIALPACKED BEDFINALA = 2l ldpDp 是柱中填料的直径 ， l 是填充因子。纵向扩散质的转移不平衡Stationary phase mass transferMobile phase mass transfer 分离度HPLC的方法开发第一步 想办法得到各种信息 向同行了解是否做过此类样品，或有否类似样品的分析方法 查文献，如CA(化学文摘) 仪器制造商的文献 对色谱柱有足够的了

10、解 掌握分离机理，自己开发方法 充分了解您自己的样品分析时要了解哪方面的情况？ 灵敏度的要求有多高? 样品的本底是否很复杂? 有多少组份要分析? 对分析的精确度、准确度等有多高要求? 是否因是日常检验，而要求方法容易使用? 分离时要了解哪方面的情况？ 要分离（即制备）的样品量有多大? 要分离的组份在样品中的含量很高? 还是微量? 是否需要保持生物活性? 对分离产物纯度的要求有多高? 纯度或活性的鉴定如何完成?方法开发的其他因素 流速对柱效的影响 不同内径的色谱柱有自己的最佳流速 样品的进样量(浓度)对柱效的影响 样品的进样体积对柱效的影响 溶剂粘度对柱效的影响以上因素均影响分离度Increas

11、ing polarityWater-insolubleWater-solubleNonpolarIonicNonionic polar1.0E+021.0E+031.0E+041.0E+051.0E+06Molecular WeightAdsorptionPartitionIonexchangeReversed-PhasePartitionNormal-PhasePartitionExclusionGel permeationGel filtration一般的具体步骤 先用一根短的色谱柱 用相对较高的流速 使用尽可能纯度高的标准品 先用高强度的洗脱液 调节k 值改变保留值 调节a值改变选择性

12、调节柱长度改变柱效及分离速度请请记记住住 每每次次改改变变一一个个参参数数改善选择性a的方法改变溶剂强度优点：简单方便，在0.5kk（首峰）的样品改变溶剂类型(ACN, MeOH, THF)优点：当仅改变溶剂强度不足时，改变a的有效办法缺点：由于需要更多的实验，故不如改变溶剂强度方便混合不同溶剂优点：分离一对以上的关键峰时，可提供中间选择性；扩展了改变溶剂类型的 应用范围缺点：需大量实验不方便改变柱类型优点：在改变选择性方面与改变溶剂强度效果相当，当仅有一种溶剂类型可用时，改变柱类型则非常有用缺点：不方便，因为必须安装新柱，并需重新平衡。将不同类型色谱柱串联起来使用，以获得中间选择性的实用价值

13、不大（而混合溶剂则较好）改变柱温优点：如柱温可以控制，则非常方便缺点： a随柱温的变化通常小于其它条件Polarities of common organic functional groups:Aliphatic Hydrocarbons Olefins Aromatic HydrocarbonsHalidesR - ClSulfidesR - SEthersNitro - compoundsEstersAldehydesKetonesAlcoholsR - OHAminesR - NH2SulfonesR - SO2 - OHSulfoxidesR - SO - R AmidesR CO

14、NH2 Carboxylic acidsR - COOHWaterIncreasing PolarityCHCH2RR-NO2CH2RRCH3OCH3ROORRCOHRCOR反相色谱的方法开发实例 色谱条件： 色谱柱：C18，4mm30mm 流动相：乙腈/水，不同的溶剂强度，60/40、50/50、40/60，由强渐弱 流速：2ml/min 样品： 对羟基苯甲酸甲酯(Methyl Paraben) 对羟基苯甲酸丙酯(Propyl Paraben) 对羟基苯甲酸丁酯(Butyl Paraben)改变容量因子 K60/4050/5040/60谱图改变选择性a 通过改变流动相改变选择性 同样强度的不

15、同溶剂62:38/42:58/72:28/2322，OHCNCHOHMeOHOHTHF梯度洗脱的特点 优点 单位时间的分离能力增加 检测灵敏度提高 缺点 仪器设备要求高 不适合某些检测方式 柱需再生 定量分析的重复性较低梯度的洗脱方式 高压梯度及低压梯度溶剂 A溶剂 B泵 A泵 B混合器A 高压梯度溶剂 A泵溶剂 B比例阀（溶剂混合点）混合器B 低压梯度（溶剂混合点）梯度洗脱的可变参数 A及B液的成分和化学特性 梯度的陡度 梯度的变化形状124356789 10 11梯度方法开发实例 - 第一步 开发一个有9个烷基苯酮化合物的梯度方法，用C18柱，在最初的条件下(0-100% 水-乙腈)，分离

16、不理想。整个色谱峰组保留时间太长，分离度也不好。梯度方法开发实例 - 第二步 为使色谱峰前移，提高起始时乙腈的比例（50-100%，水-乙腈），分离得到改善。但是9个化合物出了10个色谱峰，说明有杂质存在，很可能是流动相水中的。梯度方法开发实例 - 第三步 从空白梯度图显示，在同样的色谱条件，同样的检测灵敏度下，共有两个杂质峰。说明流动相水中的杂质在此条件下可能会对检测有影响。梯度方法开发实例 - 第四步 空白梯度图同样品的色谱图进行对照后，我们看到杂质（共两个峰）中的第一个小峰对第8个色谱峰有干扰，会使其定量分析结果不准确。梯度方法开发实例 - 第五步 根据“梯度曲线下的面积越大，洗脱能力越

17、强”的规律，试用#5曲线使3-9号峰提前(曲线5，50-100%B)，但是小峰仍没有分出来。梯度方法开发实例 - 第六步 根据“梯度曲线下的面积越大，洗脱能力越强”的规律，试用#5曲线使3-9号峰提前，改用50-95%B见到好的现象。梯度方法开发实例 - 第七步 最后用50-90%B，曲线4，得到好的结果。色谱峰定性 鉴别每个色谱峰 通过比较保留值(通常是保留时间)的方法，找到各色谱峰所对应的组份 大多数情况下用比较保留时间来定性即所谓：保留时间相同，可能是同样的组份保留时间不同，肯定不是同样的组份用保留时间定性 用“标样”的保留值定出被测组份的位置0.000.050.100.150.200.

18、250.300.350.400.000.501.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.006.507.00AUMinutesUracilEthylparabenPropylparaben进一步的确认 标准加入 同时用其他方法 其他色谱方法（改变机理，如：用不同的色谱柱） 其他检测器 PDA，光谱图比较、谱库检索 MS，质谱图解析、谱库检索 其他仪器方法峰一致性的确认 确认色谱峰的纯度 保证每个色谱峰下只有一个被测的组份 检查是否有共流出的物质（杂质）干扰 色谱峰纯度确认的方法 用光电二极管矩阵检测器比较光谱图 峰纯度鉴定，双波长Ratio用二极管矩阵检

19、测器比较光谱图 苯的色谱及光谱图（Index）240.00260.00280.000.000.100.200.300.400.400.801.201.602.002.402.80定量分析的具体内容 确定样品的类型，主要成分/痕量成分 使分析条件的分离度（R）大于：1.5 色谱峰的定性，峰一致性测定 检测限及定量限：确定灵敏度及线性范围 用标样建立标准曲线 检查方法的准确度及精确度 用标样定期检查方法痕量分析如信/噪比不够，定量的精确度会受影响，因此要：分析前浓缩样品选择高灵敏度检测器用衍生法使色谱体系最优化使用短的微径柱（减少样品的稀释）使用高效色谱柱使k值尽可能小增加进样体积和浓度使用低流速

20、（N增加）采用梯度淋洗准确度的影响因素 标样的可靠性及其配制的准确度 色谱方法的可靠性 色谱泵的精确度（GPC的影响更大） 进样器的准确度，进样技术流速与检测面积的关系 如在不改变系统效率的情况下，流速降低峰高几乎不变，然而峰面积与流速相应成反比增加。AR dtAAtt121212n ml/minn/2 ml/mint1t2t1 t2A1A2溶剂强度、K及峰高的关系样 品15l对二甲氧基苯色谱柱Resolve Silica溶 剂二氯甲烷/戊烷 从85:75到60:45k =3.0k =1.9k =4.9k =1.5柱效和峰高的关系 如其他因素不变，如：K，a，流速等，柱效增加峰面积基本不变，而

21、峰高增加。6241 .01 .11 .2231常用的定量方法 峰面积百分比法 由于检测技术的影响，在液相色谱中不常用 外标法 在液相色谱中用的最多 内标法 准确，但是麻烦 在标准方法中用的最多峰面积百分比法定量 公式： 特点： 各组分要全部流出、全部被检测，并对检测器的响应值一样简单，液相色谱目前很难做到这点 与进样量无关 不需标样 简单%100%iAiAC外标法定量 (一) 配制一系列已知浓度的标样外标法定量（二） 实际色谱图0 .0 00 .0 50 .1 00 .1 50 .2 00 .2 50 .3 00 .0 00 .5 01 .0 01 .5 02 .0 02 .5 03 .0 0

22、3 .5 04 .0 04 .5 05 .0 05 .5 06 .0 06 .5 07 .0 0M in u te s0 .0 00 .0 50 .1 00 .1 50 .2 00 .2 50 .3 00 .0 00 .5 01 .0 01 .5 02 .0 02 .5 03 .0 03 .5 04 .0 04 .5 05 .0 05 .5 06 .0 06 .5 07 .0 0M in u te s0 .0 00 .0 50 .1 00 .1 50 .2 00 .2 50 .3 00 .0 00 .5 01 .0 01 .5 02 .0 02 .5 03 .0 03 .5 04 .0 04 .5 05 .0 05 .5 06 .0 06 .5 07 .0 0M in u te s05010015020025001,0002,0003,0004,0005,000样品浓度响应值峰面积()标准曲线外标法定量（三） 计算公式 特点 无