高效液相色谱仪的使用和不易挥发有机化合物的定性分析

1、华南师范大学实验报告学生姓名:黄敬霞学号:20092401147专业:化学师范年级、班级:09级化四课程名称:近代有机分析方法和实验实验时间:2011年10月12日高效液相色谱仪的使用和不易挥发有机化合物的定性分析一、实验目的:1、学习使用高效液相色谱仪,掌握保留时间的概念和定性分析2、通过对样品的定性测定,初步掌握获得高效液相色谱图和数据的一般操作程序与技术二、实验原理:高效液相色谱分是由储液器、泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部份组成。由于样品溶液中的各组分在色谱柱中两相中的分配系数不同,当试样随流动相进入色谱柱后,组分就在两相间进行反复多次的分配,由于固定相对各种组分的吸附能力不同

2、,各组分在色谱柱中的运行速度就不同,经过一定柱长后彼此分离,依次从色谱柱流出,通过检测器时样品浓度被转换成电信号传送到记录仪,数据以图谱形式打印出来。三、实验仪器与试剂:1、仪器:岛津液相色谱仪,SPD-20A检测器,LC-20AT泵,微量进样器,C18色谱柱2、试剂:烟酸乙酯,甲醇(AR,色谱纯,超纯水四、实验步骤:1、准备1.1准备所需的流动相,用合适的0.45m滤膜过滤,超声脱气20min。(这里用的是流动相是甲醇(B和超纯水(A,分别用有机相系和水相系的0.45µm滤膜过滤,超声脱气20min。1.2根据待检样品的需要更换合适的洗脱柱(注意方向和定量环。1.3配制样品和标准溶

3、液(也可在平衡系统时配制,用合适的0.45m滤膜过滤。(即用移液管量取0.5 mL的烟酸乙酯用甲醇定容在5 mL的容量瓶中(105ppm,然后用移液管量取1 mL刚定容的溶液并用甲醇稀定容在10mL的容量瓶后(104 ppm并用移液管量取1 mL刚定容的溶液并用甲醇稀定容在10mL的容量瓶中,这样就配制成浓度为1000ppm,用0.45µm有机滤膜过滤。1.4检查仪器各部件的电源线、数据线和输液管道是否连接正常。2、开机接通电源,依次开启不间断电源、B泵、A泵、检测器,待泵和检测器自检结束后,打开打印机、电脑显示器、主机,最后打开色谱工作站(即电脑桌面上的CS-Light Real

4、Time Analysis。3、参数设定3.1波长设定:在检测器显示初始屏幕时,按func键接着按Enter键,用数字键输入所需波长值245nm,按Enter键确认。按CE键退出到初始屏幕。3.2流速设定:在A泵显示初始屏幕时,按func键,用数字键输入所需的流速(柱在线时流速一般不超过1ml/min,按Enter键确认。按CE键退出。3.3流动相比例设定:在A泵显示初始屏幕时,按conc键,用数字键输入流动相B的浓度百分数(80%,按Enter键确认。按CE键退出。4、更换流动相并排气泡4.1将A/B管路的吸滤器放入装有准备好的流动相的储液瓶中;4.2逆时针转动A/B泵的排液阀180

5、6;,打开排液阀;4.3按A/B泵的purge键,pump指示灯亮,泵大约以9.9ml/min的流速冲洗,3min(可设定后自动停止;4.4将排液阀顺时针旋转到底,关闭排液阀。4.5如管路中仍有气泡,则重复以上操作直至气泡排尽。4.6如按以上方法不能排尽气泡,从柱入口处拆下连接管,放入废液瓶中,设流速为5ml/min,按pump键,冲洗3min后再按pump键停泵,重新接上柱并将流速重设为规定值。5、平衡系统5.1按N2000色谱数据工作站操作规程打开"在线色谱工作站"软件,输入实验信息并设定各项方法参数后,按下"数据收集"页的 查看基线 按钮。5.2等

6、度洗脱方式5.2.1按A泵的pump键,A、B泵将同时启动,pump指示灯亮。用检验方法规定的流动相冲洗系统,一般最少需6倍柱体积的流动相。按A泵的pump键,A、B泵将同时启动,pump 指示灯亮。用检验方法规定的流动相冲洗系统,一般最少需6倍柱体积的流动相。5.2.2检查各管路连接处是否漏液,如漏液应予以排除。5.2.3观察泵控制屏幕上的压力值,压力波动应不超过1MPa。如超过则可初步判断为柱前管路仍有气泡,按4.6操作。5.2.4观察基线变化。如果冲洗至基线漂移<0.01mV/min,噪声为<0.001mV时,可认为系统已达到平衡状态,可以进样。6、进样6.1进样前在CS-L

7、ight Real Time Analysis中:(1点击“单次分析”,接着点击“样品记录”,在样品记录名称中输入所要检测得样品名称,然后点击“数据文件”选择该样品储存在哪里,最后在“数据储存的文件夹”后面输入该样品名称,点击确定。(2在信号采集菜单中设定停止时间(6 min和延迟时间(3 min。6.2进样前按检测器zero键调零,按软件中 零点校正 按钮校正基线零点,再按一下查看基线 按钮使其弹起。6.3用试样溶液清洗注射器,并排除气泡后抽取20 L。6.4进样时先注入注射器后向逆时针扳动进样阀的板扣后注入溶液再向顺时针扳动进样阀后取出注射器。7、数据处理7.1在桌面双击“CS-Light

8、 Postrum Analysis”,点击确定按钮后,在“文件夹目录中”选中该样品记录双击鼠标,在谱图上单击鼠标右键的“显示设置”,在“显示设置”中选择“展开色谱”的“时间”填写“0”到“20”后点击确定7.2用鼠标点击“编辑”选择“积分”中的“最小峰面积/高”输入“最小峰面积值”,然后点击“查看”。7.3复制谱图到Word文档,在谱图中点击鼠标右键选择“复制”;复制数据,单击鼠标左键全选,然后鼠标右键“复制表格到剪贴板(b”。8、关闭仪器分析完毕后,关闭色谱工作站,再自上而下关闭仪器。五、数据记录甲醇的液相色谱图 0.0 2.5 5.07.510.012.515.017.5min0.01.0

9、2.03.04.05.06.07.08.0V(x100,000烟酸乙酯的液相色谱图 0.0 2.5 5.07.510.012.515.017.5min0.01.02.03.04.05.06.07.0V(x100,0004.303 六、结果分析及讨论定性分析:在液相色谱分析中,当实验条件设置在合适位置并保持不变的时候,在样品能保证检测的前提下,对实验结果影响最大的就是实验过程中实验者的操作是否标准及规范。一般说来,整个实验过程中进样操作应由同一人进行,以防个体操作差异而引起实验数据出现误差。本实验运用液相色谱法对烟酸乙酯进行定性分析,其中流动相是选用甲醇与水的8:2混合液,在该液相色谱实验中,甲

10、醇无(强吸收峰,利于样品的检测。在样品进样后4.303min 处出现一强吸收峰,利用保留时间能方便快捷判断出样品,该峰属于烟酸乙酯。七、思考题1、液相色谱法和气相色谱法有何区别?答:高效液相色谱分析法(HPLC,它的基本概念及理论基础(如保留值、塔板理论、速率理论、容量因子、分离度等,与气相色谱是一致的,但又有不同之处:高效液相色谱与气相色谱的主要区别可归结于以下几点:(1进样方式的不同:高效液相色谱只要将样品制成溶液,而气相色谱需加热气化或裂解;(2流动相的不同,在被测组分与流动相之间、流动相与固定相之间都存在着一定的相互作用力;(3由于液体的粘度较气体大两个数量级,使被测组分在液体流动相中

11、的扩散系数比在气体流动相中约小45个数量级;(4由于流动相的化学成分可进行广泛选择,并可配置成二元或多元体系,满足梯度洗脱的需要,因而提高了高效液相色谱的分辨率(柱效能;(5高效液相色谱采用510Lm细颗粒固定相,使流体相在色谱柱上渗透性大大缩小,流动阻力增大,必须借助高压泵输送流动相;(6高效液相色谱是在液相中进行,对被测组分的检测,通常采用灵敏的湿法光度检测器,例如,紫外光度检测器、示差折光检测器、荧光光度检测器等;(7液相色谱与气相色谱相比较,高效液相色谱同样具有高灵敏度、高效能和高速度的特点。高效液相色谱的定性和定量分析,与气相色谱分析相似,在定性分析中,采用保留值定性,或与其他定性能

12、力强的仪器分析法连用;在定量分析中,采用测量峰面积的归一化法、内标法或外标法等,但高效液相色谱在分离复杂组分式样时,有些组分常不能出峰,因此归一化法定量受到限制,而内标法定量则被广泛使用。3、色谱分离方式应如何选择?答:(1根据相对分子质量选择低相对分子质量(400的试样因其挥发性强,宜采用气相色谱分离;相对分子质量大于2000的化合物可采用液相色谱分离;相对分子质量介于1002000范围内的分子,应视试样性质选用液-固吸附色谱、液-液分配色谱或离子交换色谱分离。(2根据溶解性选择水溶性离子化合物与共价化合物可分别采用离子交换色谱或液-液分配色谱分离。对于非水溶性化合物,若易溶于烃类溶剂,可采用液-固吸附色谱分离;若溶于二氯甲烷或氯仿,可采