健康人血细胞流式细胞术参数正常值的建立及其意义

1、    健康人血细胞流式细胞术参数正常值的建立及其意义        【摘要】目的：为了探讨健康人外周血细胞流式细胞术参数的正常值及其波动范围。方法：用流式细胞术对88例健康成年人血细胞的DNA、RNA、蛋白质含量，细胞动力学，机体免疫状态，细胞因子和基因蛋白表达水平等32个指标进行了检测分析。结果：获得了88例健康人血细胞32项流式细胞术参数正常值的平均值、标准差和分布范围。结论：本结果可作为健康人外周血细胞流式细胞术参数的正常参考值，供基础和临床研究参考。【关键词】流式细

2、胞术；参考值；血细胞表型中分类号：R73.36文献标识码：A文章编号：1009-4571(2000)02-0123-03Establishment of normal reference values of flow cytometric parameters in peripheral blood cells and its significance on healthy personsZHOU Zhen-ying,ZHU Yue-qing,WU Xiao-liu,et al.(Jiangsu Institute of Cancer Research,Nanjing 210009)【Abst

3、ract】Objective：To investigate the normal reference value and the distributed range of flow cytometric parameters in peripheral blood cells on healthy persors.Methods：32 flow cytometric parameters of 88 healthy individuals were measured by flow cytometry.These parameters included DNA content,RNA cont

4、ent,protein content of cells,cellular kinetics,immune status,cytokines and expression of gene protein.Results：Average values,standard error and distributed ranges of 32 flow cytometric parameters in peripheral blood cells were obtained on 88 cases of healthy individuals.Conclusions：These results may

5、 regarded as normal reference values of flow cytomtrc parameters in peripheral blood cells on healthy persors.It may be used in normal reference values of basis and clinical medical study.【Key words】flow cytometry;refernce value;blood cell phenotype对88例健康人外周血细胞采用三色、双色或单色荧光抗体直接标记法，用流式细胞术(Flow cytomet

6、ry,FCM)检测了正常人血细胞32项指标的正常参考值。结果报道如下。1材料与方法1.1材料职工健康体检中选取88例健康成年人，男50例，女38例；年龄2073岁，中位年龄43岁。受检者体检健康，血细胞计数及肝肾功能均正常，近半年来未接触放射线，近1个月来无服药史。1.2方法1.2.1实验样品取受检者静脉血4ml，肝素抗凝，2ml用于DNA、RNA、蛋白质含量、细胞动力学(增殖活性和凋亡水平)和基因蛋白表达水平检测，以淋巴分离液分离单个核细胞；另2ml血以全血溶血荧光直标单克隆抗体检测血细胞表面标志。1.2.2检测试剂及单克隆抗体PI、PY、FITC购自美国Sigma公司，CD系列单克隆抗体(

7、三色、双色及单色荧光标记)、基因蛋白单克隆抗体等购自Beckman-Coulter苏州公司或PharMingen深圳晶美公司。1.2.3仪器FCM型号为FACSCalibur，美国BD公司产品，氩离子激光，功率15mW，激发光源波长为488nm。1.2.4样品制备及分析方法DNA、RNA、蛋白质含量检测，按本实验室制样检测常规进行。细胞表面标志和基因表达蛋白等检测按厂家提供的试剂说明书进行。采用全血溶血荧光抗体直接标记法。根据单抗的Ig亚类及荧光标记不同，分设相应的阴性同型对照。样品在6h内测毕。具体操作程序：取全血或分离单个核细胞稀释液100 ml加10 ml单抗试剂，室温避光反应20min

8、，然后全血标本加2 ml溶血剂，5min后离心去上清，加0.51.0ml PBS稀释，混匀后上机检测。用BD公司提供的Cellquest软件程序获取(12)×104细胞，其中CD34获取5×104细胞，除DNA含量分析用Modifit Lt程序外，其余指标均采用Cellquest程序分析。1.2.5检测指标(1)细胞成分：DNA、RNA、蛋白质含量。(2)细胞动力学：细胞增殖活性和细胞凋亡水平。(3)免疫功能：T细胞及其亚群Th和Ts，B细胞，NK细胞。(4)活性免疫细胞：T活性细胞和B活性细胞。(5)T细胞亚群的亚群细胞：细胞毒T细胞、抑制T细胞、T辅助诱导亚群细胞、T抑

9、制诱导亚群细胞。(6)细胞因子：白介素-2受体细胞。(7)其他血细胞表面标志：单核/巨噬细胞、粒细胞、T细胞受体共刺激分子、整合素链、C3b受体、造血干(祖)细胞、白细胞、粘附分子，凋亡相关蛋白等。(8)基因表达蛋白：P53(V)蛋白和P-170糖蛋白。1.3统计学分析检测结果采用数学均数及标准差表达其分布情况。2结果2.1细胞成分参数的分布健康人外周血细胞DNA、RNA、蛋白质含量检测，以在直方上二倍体G0/1期细胞分布的平均道数为标准，计算各例的DNA指数(DI)、RNA指数(RI)和蛋白质荧光指数(FI)及其分布情况(表1)。表1血细胞DNA、RNA、蛋白质含量分布项目例数均值±

10、;标准差分布范围DI881.00±0.0020.971.03RI8810.00±0.0069.2511.00FI881.02±0.050.971.062.2血细胞动力学参数分布细胞动力学增殖活性和凋亡水平。SPF(S-Phase fraction,SPF)代表血细胞增殖活性；Apo(Apoptosis)代表细胞凋亡水平，Annexin-V双标记法检测早期凋亡细胞，DNA含量法检测晚期凋亡细胞(表2)。 表2血细胞增殖活性和凋亡水平的分布项目例数均值±标准差分布范围SPF880.33±0.2601.20Apo(早期)881.72±1.5

11、80.416.93Apo(晚期)880.15±0.1300.532.3免疫细胞及其他细胞检测对88例受检者的检测结果见表3。 表3免疫细胞表面标志表达水平及分布范围细胞细胞表型均值±标准差分布范围成熟T细胞CD+364.60±10.7135.5085.40T辅助/诱导细胞亚群CD+3CD+438.88±8.7720.4049.40T抑制/细胞毒细胞亚群CD+3 CD+825.69±6.469.80-40.40免疫状态CD+3 CD+4/CD+3 CD+81.53±0.580.813.60B细胞CD+198.88±3.324.

12、3514.98NK细胞CD-3/CD+(16+56)21.52±8.609.3739.50活性T细胞CD+3/HLA-DR+5.04±2.870.6711.66静止T细胞CD+3/HLA-DR-356.20±11.4419.5474.69活性B细胞CD-3/HLA-DR+9.59±4.132.9319.28静止B细胞CD-3/HLA-DR-14.83±3.977.0322.34细胞毒T细胞CD+8/CD+2812.23±5.134.0021.66T抑制细胞CD+8/CD-2824.10±10.489.5456.49T辅助细胞

13、诱导亚群CD+4/CD+2918.18±4.0711.1729.90T抑制细胞诱导亚群CD+4/CD+45-RA+18.19±6.3010.2848.68单核/巨噬细胞CD+145.10±2.202.199.77粒细胞CD+1548.94±11.5929.5269.19IL-2受体细胞CD+2513.05±4.196.0323.98T细胞共刺激分子CD+2843.28±8.8728.0761.94整合素1链细胞CD+2969.18±10.5350.1685.14C3b受体细胞CD+3540.71±5.1430.70

14、49.70造血干(祖)细胞CD+340.54±0.290.171.14白细胞共同抗原CD+4567.77±11.5648.5079.84粘附因子细胞CD+44(s)92.19±4.7786.23100.00凋亡相关蛋白表达细胞CD+9512.46±3.194.3020.25突变型抑癌基因蛋白P+53(V)0.66±0.5005.68多药耐药基因蛋白P-170+6.85±4.380.8616.653讨论 3.1血细胞流式参数正常参考值检测方法目前流式细胞术已广泛用于医学临床领域1，2，这就要求拿出符合现代技术水平的正常参考值。源于20世

15、纪80年代末的某些正常值4，5，显然已不适应当前工作要求。我们采用三荧光道流式细胞仪，三色、双色及单色荧光直接标记单抗技术，对88例健康人血细胞32项流式指标进行了分析。在实验过程中注意了以下几个问题：单抗的选择十分重要，如目前对Th、Ts和NK细胞的检测存在诸多歧义，如果单纯用CD+4、CD+8及CD+16或CD+56细胞分别代表Th、Ts和NK细胞时，往往出现CD+4和CD+8细胞之和大于CD+3细胞。采用T亚群三色荧光标记检测，可查出真正Th细胞(CD+3、CD+4)和Ts细胞(CD+3、CD+8)，用CD+3抗体限定CD+4和CD+8细胞方法，可避免测量值偏高现象。NK细胞检测，只有同

16、时表达CD16和CD56的抗原细胞才是NK细胞，所以采用CD(16+56)单抗是必要的。同时NK细胞又是CD-3，必须用CD-3单抗素限定CD+(16+56)细胞。因此CD-3/CD+16+56细胞才是真正的NK细胞。识别散射光上淋巴细胞群：在SSCXFSC二维散射光点阵上显示的细胞群的形态常因人而异，因溶血程度而异。尤其当淋巴细胞含量少时，溶血不充分，而淋巴细胞显示区不清晰。淋巴细胞开窗时，既不要漏掉淋巴细胞，也不要把非淋巴细胞划进来6。选择合适的单抗同型对照是十分重要的。在阴性对照荧光二维点阵上，阳性区细胞一般应小于2%，同时也注意参照样品细胞的分布情况。取材后4保存标本小于24h。分析单

17、参数指标时，荧光二维点阵表示结果或直方分析均可。3.2建立正常参考值的意义正常值是发现异常的基础，也是了解异常程度的对照。各指标检测意义如下，DNA异倍体是恶性肿瘤的标志物，这对研究肿瘤发生发展、诊断、治疗和预后判断均有重要意义2。细胞RNA和蛋白质含量分析发现，恶性肿瘤时往往出现增高，有时发生在DNA含量变化之前，同时用该指标还可以区分二倍体恶性细胞和正常细胞2。人类白细胞表面标志的检测，是评价机体免疫状态的基础68。不仅能检测各种免疫细胞(T、B、NK细胞)数量，而且还可以判断免疫细胞的质量(活性T、B、NK细胞)。此外，还能对机体免疫核心细胞T细胞的各种亚群的亚群细胞进行分析。细胞动力学

18、检测，不仅能了解细胞增殖及凋亡规律及其相互关系，而且还能判断它们与疾病发生发展、治疗、预后的关系9。基因表达蛋白检测不仅有理论意义，而且也有实际意义。因为癌基因激活、抑癌基因失活、调整基因改变都是恶性肿瘤发生发展和肿瘤转移的重要标志10。(编辑：杨明山校对：边莉)作者单位：周振英(江苏省肿瘤防治研究所南京市210009)朱月清(江苏省肿瘤防治研究所南京市210009)吴晓柳(江苏省肿瘤防治研究所南京市210009)张军妮(江苏省肿瘤防治研究所南京市210009)沈宗丽(江苏省肿瘤防治研究所南京市210009)参考文献：1左连富.流式细胞术与生物医学M.沈阳：辽宁科学技术出版社，1996，129

19、-401.2Barlogie B,Rber MN,Schman J,et al.Flow cytometry in clinical cancer reserchJ.Cancer Res,1983,43:3928-930.3周振英，张军妮，顾平，等.大肠癌中心灶、癌旁和淋巴结转移灶细胞DNA倍体的流式细胞计量术分析J.河南肿瘤学杂志，1996，9(2)：81-83.4张鲁榕，孔宪涛，张浩，等.流式细胞计分析T淋巴细胞亚群J.生物化学与生物物理进展，1989，16(2)：157-159.5Tollerud DJ,Clark JW,Morris-Brown L,et al.The influence of age,race and gender on peripheral blood mononuclear cell subsets in healthy nonsmokers J.J Clin Immunol,1989,9:214-215.6Kagan JM,Mayall B