动物组织基因组的提取

1、实验一、动物组织基因组DNA提取一、实验目的一、实验目的二、实验原理二、实验原理1、核酸的分类、核酸的分类l DNA ( DNA (脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸) ) 主要存在于细胞核的染色体中。主要存在于细胞核的染色体中。 核外也有少量核外也有少量DNADNA，如线粒体，如线粒体DNADNA（mtDNAmtDNA），叶绿体），叶绿体DNADNA（cpDNAcpDNA），质粒），质粒DNADNA。l RNA RNA（核糖核酸）（核糖核酸） 存在于细胞质中，如存在于细胞质中，如mRNA, rRNA, tRNAmRNA, rRNA, tRNA等。等。l 除上述除上述DNADNA，RNARNA外，外，还

2、有非细胞形式存在的病毒和噬还有非细胞形式存在的病毒和噬 菌菌体，其或只含体，其或只含DNADNA，或只含有，或只含有RNARNA。核酸的理化性质核酸的理化性质l在细胞内通常与蛋白质结合，以复合物形式存在在细胞内通常与蛋白质结合，以复合物形式存在2、核酸制备的一般原则、核酸制备的一般原则l微溶于水，不溶于乙醇，氯仿等有机溶剂微溶于水，不溶于乙醇，氯仿等有机溶剂l在酸性溶液中容易降解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。在酸性溶液中容易降解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。lDNADNA溶液粘度很大，溶液粘度很大，RNARNA的粘度较小的粘度较小l在强大离心力的作用下，可以从溶液中沉降下来在强大离心力的作用下

3、，可以从溶液中沉降下来l分离纯化核酸总的原则：分离纯化核酸总的原则：2、核酸制备的一般原则、核酸制备的一般原则l核酸纯化应达到的要求：核酸纯化应达到的要求： 核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂有机溶剂和过高和过高浓度的浓度的金属离子金属离子； 其它生物大分子的污染应降低到最低程度；其它生物大分子的污染应降低到最低程度； 排除其它核酸分子的污染。排除其它核酸分子的污染。 应保证核酸一级结构的完整性；应保证核酸一级结构的完整性； 排除其它分子排除其它分子( (蛋白，脂类，多糖类蛋白，脂类，多糖类) )的污染。的污染。l核酸制备时应注意的事项核酸制备时应注意

4、的事项: : 尽量简化操作步骤，缩短提取过程。尽量简化操作步骤，缩短提取过程。 减少化学因素对核酸的降解。减少化学因素对核酸的降解。 减少物理因素对核酸的降解：机械剪切力和高温减少物理因素对核酸的降解：机械剪切力和高温 防止核酸的生物降解：排除防止核酸的生物降解：排除核酸酶核酸酶。 排除其它核酸分子的污染，如提取排除其它核酸分子的污染，如提取DNADNA分子时，应去除分子时，应去除RNARNA，反之亦然。，反之亦然。 降低温度，改变降低温度，改变pHpH及盐的浓度，都利于对核酸酶活性及盐的浓度，都利于对核酸酶活性的抑制，但均不如利用核酸酶抑制剂更有利，当然，的抑制，但均不如利用核酸酶抑制剂更有

5、利，当然，几个条件并用更好。几个条件并用更好。 对于对于DNADNA，抑制，抑制DNaseDNase活力很容易，但防止机械张力活力很容易，但防止机械张力拉断则更重要。拉断则更重要。 对于对于RNARNA，因分子较小，不易被机械张力拉断，但抑，因分子较小，不易被机械张力拉断，但抑制制RNaseRNase活力较难，故在活力较难，故在RNARNA提取中设法抑制提取中设法抑制RNaseRNase更更重要。重要。核酸酶的抑制和抑制剂核酸酶的抑制和抑制剂 lDNase抑制抑制 加入少量金属离子螯合剂，如加入少量金属离子螯合剂，如0.01 mol/L EDTA0.01 mol/L EDTA或柠檬酸钠，或柠檬

6、酸钠，DNaseDNase基本可以全部失活。基本可以全部失活。 去垢剂、蛋白变性剂及去垢剂、蛋白变性剂及DNaseDNase抑制剂也可使抑制剂也可使DNaseDNase失活。失活。lRNase抑制抑制 操作要带手套。操作要带手套。 所有器皿要严格消毒，所有器皿要严格消毒， 试剂处理试剂处理 低温操作低温操作 在分离过程中要加入一定的在分离过程中要加入一定的RNase抑制剂。抑制剂。 常用的常用的RNA酶抑制剂酶抑制剂 焦磷酸二乙酯（焦磷酸二乙酯（DEPC） 抑制强烈、不彻底抑制强烈、不彻底 异硫氰酸胍异硫氰酸胍 有效抑制、分解核蛋白有效抑制、分解核蛋白 氧钒核糖核苷复合物氧钒核糖核苷复合物 有

7、效抑制有效抑制 RNA酶的蛋白抑制剂（酶的蛋白抑制剂（RNasin） 有效抑制有效抑制 其它：其它：SDS、尿素、硅藻土等、尿素、硅藻土等 有效抑制有效抑制l核酸制备中常用的去垢剂核酸制备中常用的去垢剂 核酸本身带负电荷，结合带正电荷的蛋白质。用于核酸核酸本身带负电荷，结合带正电荷的蛋白质。用于核酸提取的去垢剂，一般都是阴离子去垢剂。提取的去垢剂，一般都是阴离子去垢剂。 去垢剂的作用：去垢剂的作用： 1 1溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂；溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂； 2 2溶解核糖体上面的蛋白质，使其解聚，将核酸释放出溶解核糖体上面的蛋白质，使其解聚，将核酸释放出来；来； 3 3对对RNa

8、se、DNase有一定的抑制作用。有一定的抑制作用。如：如：SDS、脱氧胆酸钠、脱氧胆酸钠、4-4-氨基水杨酸钠、萘氨基水杨酸钠、萘-1.5-1.5-二磺酸钠、二磺酸钠、三异丙基萘磺酸钠三异丙基萘磺酸钠 作用：作用： 1. 1.使蛋白质变性、沉淀，从核酸提取液中分离除去，以防造使蛋白质变性、沉淀，从核酸提取液中分离除去，以防造成蛋白污染。成蛋白污染。 2. 2.使蛋白质变性，故可使核糖体解聚释放出核酸。使蛋白质变性，故可使核糖体解聚释放出核酸。 3. 3.某些蛋白质变性剂也有抑制某些蛋白质变性剂也有抑制 RNase活性和破裂细胞的作活性和破裂细胞的作用。用。 如：苯酚、氯仿、盐酸胍、如：苯酚、

9、氯仿、盐酸胍、DEPC核酸制备中常用的蛋白质变性剂核酸制备中常用的蛋白质变性剂l核酸制备中常用的酶核酸制备中常用的酶 DNase: :降解降解DNADNA RNase：降解：降解RNARNA 蛋白酶蛋白酶K K：降解蛋白质：降解蛋白质 溶菌酶溶菌酶：破碎细胞：破碎细胞 3. 核酸制备的一般步骤：核酸制备的一般步骤：I. I.材料准备材料准备II.II.破碎细胞或包膜内容物释放破碎细胞或包膜内容物释放III.III.核酸分离、纯化核酸分离、纯化IV.IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质沉淀或吸附核酸，并去除杂质V.V.核酸溶解在适量缓冲液或水中核酸溶解在适量缓冲液或水中1 1）破碎细胞）破碎细胞（防

10、止核酸酶的作用）（防止核酸酶的作用） 微生物微生物：溶菌酶、：溶菌酶、SDSSDS裂解。裂解。 高等植物高等植物：捣碎器破碎、液氮研磨。：捣碎器破碎、液氮研磨。 酶法：蛋白酶，如胰蛋白酶，酶法：蛋白酶，如胰蛋白酶， 冰冻法：反复冻融或液氮冻后组织捣碎。冰冻法：反复冻融或液氮冻后组织捣碎。 动物动物：液氮处理后用匀浆器或者研钵破碎。：液氮处理后用匀浆器或者研钵破碎。 细胞器细胞器DNADNA：首先纯化细胞器。：首先纯化细胞器。以上处理时均要同时加入核酸酶抑制剂以上处理时均要同时加入核酸酶抑制剂2 2）破碎抽提核酸除去杂质）破碎抽提核酸除去杂质首先使脱氧核糖核蛋白、核糖体、病毒的核蛋白与其它首先使

11、脱氧核糖核蛋白、核糖体、病毒的核蛋白与其它成分分离成分分离使核酸与蛋白质分离使核酸与蛋白质分离除去脂类除去脂类 多糖的除去多糖的除去 3 3）核酸的纯化）核酸的纯化 根据所需核酸的性质和特点除去其它核酸污染根据所需核酸的性质和特点除去其它核酸污染, ,并除去提取过程中的系列试剂并除去提取过程中的系列试剂( (盐、有机溶剂等）盐、有机溶剂等）杂质，最后得到均一的核酸样品。杂质，最后得到均一的核酸样品。 4 4）核酸样品的保存）核酸样品的保存 核酸保存的主要条件是核酸保存的主要条件是温度温度和和介质介质 温度温度： 4 4 样品经常使用样品经常使用 -70 -70是长期保存的良好温度，为一次性保存

12、是长期保存的良好温度，为一次性保存 -20 -20保存保存, ,避免反复冻融避免反复冻融 保存介质保存介质： 灭菌水灭菌水 TETE缓冲溶液缓冲溶液( (最常用最常用) )： 10mmol/LTris-ClpH8.01mmol/LEDTApH8.0三、动物基因组三、动物基因组DNA的提取的提取主要方法：主要方法：(1)浓盐法浓盐法利用利用RNP和和DNP在电解溶液中溶解度不同，将二者分离。在电解溶液中溶解度不同，将二者分离。1）用）用1M氯化钠提取氯化钠提取,得到的得到的DNP粘液粘液2)与含有少量辛醇的氯仿一起摇荡与含有少量辛醇的氯仿一起摇荡,使乳化使乳化3)离心除去蛋白质离心除去蛋白质,此

13、时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而中间，而DNA位于上层水相中位于上层水相中4)用用2倍体积倍体积95%乙醇可将乙醇可将DNA钠盐沉淀出来钠盐沉淀出来.三、动物基因组三、动物基因组DNA的提取的提取（2）阴离子去污剂法）阴离子去污剂法:用用SDS或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性,可以直接从生物材料中可以直接从生物材料中提取提取DNA。由于细胞中由于细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合,而阴离子而阴离子去污剂能够破坏这种价键去污剂能够破坏这种价键,所以常用阴离子去污剂提取所以常用阴

14、离子去污剂提取DNA。三、动物基因组三、动物基因组DNA的提取的提取（3）苯酚抽提法）苯酚抽提法:苯酚作为蛋白变性剂苯酚作为蛋白变性剂,同时抑制了同时抑制了DNase的降解作用。的降解作用。用苯酚处理匀浆液时用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与由于蛋白与DNA连接键已断连接键已断,蛋白分子表面又蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。离心分层后取出水层，多次溶于水相。离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并含重复操作，再合并含DNA的水相。的水相。利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀利用核酸不溶于醇的性质，用

15、乙醇沉淀DNA。此法的特点是使提取。此法的特点是使提取的的DNA保持天然状态保持天然状态。DNA的提取：的提取：苯酚抽提法（试剂盒）苯酚抽提法（试剂盒）1. 材料、设备及试剂材料、设备及试剂材料：材料：冷冻或新鲜猪肝组织冷冻或新鲜猪肝组织设备：设备：EP管、微量取液器管、微量取液器(20l,200l,1000l)，台式高速台式高速离心机，离心机，涡旋振荡器涡旋振荡器试剂：试剂：RNase ARNase A、Proteinase KProteinase K、Lysis Buffer Lysis Buffer 、Wash buffer Wash buffer A A、 Wash buffer B

16、Wash buffer B、TE bufferTE buffer。实验前：实验前：Wash buffer AWash buffer A中加入中加入18ml 18ml 无水乙醇，充分混匀；无水乙醇，充分混匀； Wash buffer B Wash buffer B中加入中加入64ml 64ml 无水乙醇，充分混匀无水乙醇，充分混匀1）样品预处理样品预处理取新鲜动物组织取新鲜动物组织25-50mg（组织量不宜过多，否则容易（组织量不宜过多，否则容易导致裂解不完全而堵塞离心柱），组织剪碎或者切成小导致裂解不完全而堵塞离心柱），组织剪碎或者切成小块，直接放入匀浆器中匀浆。块，直接放入匀浆器中匀浆。2）

17、加入加入600l的的LysisBuffer，颠倒充分混匀。如需消，颠倒充分混匀。如需消化化RNA，可加入，可加入20lRNaseA，颠倒混匀，室温放置，颠倒混匀，室温放置5min。3）加入加入10lProteinaseK，混匀。，混匀。56水浴水浴45min-1h，其间颠倒混匀数次直到看到组织完全裂解，裂解完全的其间颠倒混匀数次直到看到组织完全裂解，裂解完全的标准为液体变得清亮及粘稠。（此步骤可以过夜处理）标准为液体变得清亮及粘稠。（此步骤可以过夜处理）2. 操作步骤操作步骤n4）12,000 rpm 12,000 rpm 离心离心10 min10 min，将上清转入新的离心管，将上清转入新的

18、离心管中，加入中，加入800 l 800 l 无水乙醇，混匀。无水乙醇，混匀。n5）将液体转入离心柱（一次加不完，可分次转入），将液体转入离心柱（一次加不完，可分次转入），12,000 rpm 12,000 rpm 离心离心1min1min，弃废液。，弃废液。n6） 加入加入700 l Wash buffer A700 l Wash buffer A（使用前请先检查是（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），否已加入无水乙醇），12,000 rpm 12,000 rpm 离心离心30 s -1 min30 s -1 min，弃废液。弃废液。n 7）加入加入700 l Wash buffer B（使

19、用前请先检查是（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），否已加入无水乙醇）， 12,000 rpm 离心离心30 s -1 min，弃废液。，弃废液。8）加入加入500lWashbufferB，12,000rpm离心离心30s-1min，弃废液。弃废液。9）再次再次12,000rpm离心离心2min，将离心柱置于新的离心管，将离心柱置于新的离心管中，并打开离心柱盖，于室温或中，并打开离心柱盖，于室温或37恒温箱放置恒温箱放置510min，直至无明显乙醇味。直至无明显乙醇味。10）在硅基质膜中央加入在硅基质膜中央加入50-200lTEbuffer(事先预热事先预热55-65)，置于室温，置于室温2-

20、5min，12,000rpm离心离心30s。11）离心得到的溶液再次加入离心柱中，室温放置离心得到的溶液再次加入离心柱中，室温放置2min，12,000rpm离心离心2min。所得的溶液为纯化后的基因组。所得的溶液为纯化后的基因组DNA。称取肝脏称取肝脏0.5g冰冷的生理盐水清洗（冰冷的生理盐水清洗（3次）次）剪碎剪碎5 5mlml生理盐水生理盐水匀浆匀浆各组取各组取1/1/1010组组织细胞液织细胞液移至移至1.5ml离心管离心管加加600ulLysis BufferLysis Buffer加加20ulRNase ARNase A颠倒混匀，颠倒混匀，放置放置5min加加10ulProtein

21、ase KProteinase K混匀混匀5656水浴，水浴，45min45min颠倒混匀数次颠倒混匀数次至液体变清亮至液体变清亮及粘稠及粘稠12000rpm12000rpm，10min10min离心离心取上清转入新离心管取上清转入新离心管加加800ul无水乙醇无水乙醇混匀混匀转入离心柱转入离心柱可分次转入可分次转入12000rpm12000rpm，1min1min离心离心弃废液，加入弃废液，加入700ul Wash buffer AWash buffer A12000rpm12000rpm，1min1min离心离心弃废液，加入弃废液，加入700ul Wash buffer BWash buf

22、fer B12000rpm12000rpm，1min1min离心离心弃废液，加入弃废液，加入500ul Wash buffer BWash buffer B12000rpm12000rpm，1min1min离心离心弃废液弃废液12000rpm12000rpm，2min2min离心离心将离心柱置新离心管中，将离心柱置新离心管中，开离心柱盖，放置开离心柱盖，放置5min柱膜中央加柱膜中央加100ul65预热的预热的TE buffer放置放置3min12000rpm12000rpm，30sec30sec离心离心取离心后所得溶液再加入取离心后所得溶液再加入离心柱中，放置离心柱中，放置2min12000

23、rpm12000rpm，2min2min离心离心收集离心后所得溶液，即为纯化后基因组收集离心后所得溶液，即为纯化后基因组DNA 最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融反复冻融 提取血液基因组提取血液基因组DNADNA时，要选择有核细胞时，要选择有核细胞（白细胞）（白细胞） 细胞培养时间不能过长，否则会造成细胞培养时间不能过长，否则会造成DNADNA降降解解 含病毒的液体材料含病毒的液体材料DNADNA含量较少，提取前先含量较少，提取前先富集富集 材料应适量，过多会影响裂解，导致材料应适量，过多会影响裂解，导致DNADNA量量少，纯度低少，纯度低 针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：植物材料液氮研磨植物材料液氮研磨动物组织匀浆或液氮研磨动物组织匀浆或液氮研磨组培细胞蛋白酶组培细胞蛋白酶K K细菌溶菌酶破壁细菌溶菌酶破壁 高温温浴时，定时轻柔振荡高温温浴时，定时轻柔振荡 采用吸附材料吸附的方式分离采用吸附材料吸附的方式分离DN