离子液体双水相中吡罗红BCu与牛血清白蛋白的相互作用研

1、离子液体双水相中吡罗红B 、Cu2+与牛血清白蛋白的相互作用研Ionic liquid aqueous two-phase Pyronine B, Cu2 + and the interaction of bovine serum albumin【摘要】建立了由亲水性离子液体溴-1-甲基-3-丁基咪唑(BmimBr)和（NH4）2SO4构成的双水相体系中研究吡罗红B和牛血清白蛋白（BSA）的相互作用。结果表明吡罗红B 对牛血清白蛋白有静态猝灭作用。由计算出的热力学参数，表明吡罗红B与牛血清白蛋白主要结合作用力为静电作用力。并利用同步荧光研究了吡罗红B对BSA的构象的影响.。研究了其它金属离子对

2、BSA-PB体系的影响。其中，Cu2+ 对体系的影响是最大。因此，又进一步研究Cu2+对BSA的影响及吡罗红B对BSA- Cu2+体系的影响。【关键词】 离子液体、 离子液体双水相、牛血清白蛋白、吡罗红B、荧光猝灭。 Established by the hydrophilic ionic liquid 1-methyl 3-butyl imidazolium bromide (Bmim Br) and (NH4) 2SO4 aqueous two-phase system composed of using this to study the Pyronine B and bovine se

3、rum albumin (BSA) of each other effect. The results show that the Pyronine B on bovine serum albumin (BSA) has a static quenching effect. By the calculated thermodynamic parameters; infer the role of electrostatic and hydrophobic is Pyronine B and bovine serum albumin the major binding forces, Pyron

4、ine B on the influence of BSAs Conformation ； Pyronine B and bovine serum albumin to form a 1:1 complex. And using synchronous fluorescence to study with Pyronine B on the conformation effects of BSA. Of metal ions to bovine serum albumin - the impact of Pyronine B. Which, Cu2 + is the biggest impac

5、t on the system. Further therefore; And study Cu2 + on the BSAs affected . Study Pyronine B on the impact of BSA- Cu2 +.Key words: ionic liquids, ionic liquid aqueous two-phase, bovine serum albumin, Pyronine B, fluorescence quenching;of BSA. 目 录1 引言32 实验部分32.1 仪器和试剂33 结果与讨论33.1 荧光猝灭机制33.2 结合常数Ka和其结

6、合点数n的确定53.3 吡罗红B与BSA结合力类型的确定63.4 吡罗红B对BSA构象的影响73.5 加入不同金属离子对BSA-PB体系的影响83.6 Cu2+对BSA的影响和吡罗红B对BSA- Cu2+体系的影响104 结论 13参考文献 13一引言离子液体：是在室温附近呈液态，一般由有机阳离子和无机阴离子结合组成的盐类化合物，也称为低温熔融盐；其主要特点是没有明显的蒸汽压，热稳定性化学稳定性好。双水相:是指某些亲水性高分子聚合物的水溶液超过一定浓度后可以形成两相，并且在两相中水分均占很大比例，即形成双水相。荧光猝灭：是由荧光物质分子与溶剂分子之间所生导致的荧光强度变化或相关的激发峰位变化或

7、荧光峰位变化的物理或化学作用过程。离子液体双水相是在一定pH值下的离子液体中加入无机盐所产生分层的现象，本实验中采用BminBr和（NH4）2SO4形成的离了液体双水相体系。本试验研究了在不同温度下的离子液体BminBr双水相中吡罗红B 对牛体血清白蛋白的作用为静态猝灭过程，从计算结果（吡罗红B与牛血清白蛋白的结合常数，结合比和结合过程中的热力学参数H，S，G）得出吡罗红B与牛血清白蛋白之间的作用力主要是疏水作用和静电作用。并且讨论了Cu2+、Mn2+、Zn2+、Mg2+和K+各金属离子加入PB-BSA体系对体系的影响和深入探讨Cu2+对BSA的影响和PB对Cu2+-BSA影响二、实验部分1、

8、仪器和试剂TU-1901双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）；RF-5301PC荧光仪（日本岛津）；FA1104电子天平（上海良平仪器仪表有限公司）。 牛血清白蛋白（BSA）1.010-5mol/L,吡罗红B（PB）1.010-4mol/L, Tris-HCl（pH=7.4）缓冲溶液，离子液体的制备按指定方法制备。Cu2+， Mn2+ ， Zn2+ ， Mg2+， K+ （1.010-2mol/L），（NH4）2SO4（无水）。本实验所用试剂都为分析纯，所有用水均为去离子水。 2.实验方法1在15ml刻度比色管中分别加入1ml PH=7.4 Tris-HCl缓冲溶液、1ml 离

9、子液体和一定量的BSA和PB，加水定容到5ml，后加入2.0g（NH4）2SO4振动溶解，静止分层，取上层溶液于其它比色管中加水定容到所需体积并摇匀。待反应15分钟后用1cm荧光比色皿，固定激发波长280 nm,发射与激发狭缝均为5 nm,，用荧光分光光度计测其荧光发射光谱再用1cm石英比色皿，以水作参比，测其紫外吸收光谱。2在15ml刻度比色管中分别加入 1ml Tris-HCl、1ml 离子液体和一定量的BSA， Cu2+和PB，都加水定容到所需体积，后加入2.6g（NH4）2SO4振动溶解，静止分层，取上层溶液于其它比色管中加水定容到所需体积并摇匀。待反应15分钟后测其荧光光谱和紫外吸收

10、光谱，方法同上。三.结果与讨论3.1 荧光猝灭机制蛋白质分子因含有三种芳香族氨基酸色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸而产生较强的内源性荧光；当某些小分子与BSA结合后，会导致其荧光强度下降，这种现象称为荧光猝灭作用。根据实验方法测得吡罗红B与牛血清白蛋白的荧光光谱如图1所示；图中6、7分别为纯离子液相中和离子液相中PB，在所测范围内没有荧光峰，图1中，1为离子液相中单纯BSA的荧光光谱。实验中固定BSA的浓度，在其中加入不同浓度的PB，随着PB浓度的增加BSA的荧光强度逐渐降低；表明PB与BSA之间发生了作用，发生了荧光猝灭现象。 图1PB与BSA的荧光猝灭光谱图 Fig 1 Pyronine B an

11、d the fluorescence quenching spectra of BSA 1-5: CBSA=1.010-6 molL-1； CPB（1.010-6 molL-1）：0，3，6，12，15；6：纯离子液相中；7：CPB=1.010-6 molL-1引起BSA荧光猝灭的原因可能有动态猝灭或静态猝灭。动态猝灭是猝灭剂和荧光物质的激发态分子之间的相互作用过程；静态猝灭是猝灭剂和荧光物质分子相互作用生成不发荧光的缔合物，从而导致荧光物质荧光强度降低的过程。动态猝灭过程遵循Stern-Volmer方程：F0/F=1+KsvQ= 1+Kq0 Q (1) 其中F0为未加猝灭剂时的荧光强度；F为

12、加入猝灭剂后的荧光强度；Ksv为动态猝灭常数, 0为没有猝灭剂存在时的荧光分子的平均寿命；Kq为猝灭的速率常数；Q为猝灭剂浓度。静态猝灭过程可用下式表示： 1/(F0F)=1/F0 +1/KF0 Q （2）即： F0/F=1+KQ （2-1）其中F0为未加猝灭剂时的荧光强度；F为加入猝灭剂后的荧光强度；K（K即Ka）是基态配合物的形成常数。 从（1）和（2-1）可知，无论是动态猝灭还是静态猝灭F0/F与Q 都有线性关系，由F0/F与Q作图，如图2所示 图2不同温度下PB 对牛血清白蛋白的Stern-Volmer曲线 Fig.2 Stern-Volmer curves of BSA by Pyr

13、onine B under different temperatures.1： 25 2：35表1 PB和BSA用参数Table1 Pyronine B and bovine serum albumin interaction parametersT/KKsv（L/mol）Kq(L/mols)Ka (L/mol)2988.3941048.39410125.80181053086.4721046.47210124.4180105各类猝灭剂对生物大分子的最大扩散碰撞速率常数为2.01010L(mols)-1；从表1可知，BP对BSA荧光的猝灭过程速率常数都大于最大扩散控制的速率常数，初步判断此猝灭

14、过程为形成复合物的静态猝灭。静态猝灭过程Ksv会随温度的升高而降低，由表1可知与本实验中正相符；进一步说明PB对BSA的猝灭过程是静态猝灭过程。3.2 结合常数Ka和其结合点数n的确定 在静态猝灭中有： log（F0-F）/F=logKa+nlogQ ( 3 )由(3)作图如图3可得Ka和n如表2所示 图3不同温度下吡罗红B 对牛血清白蛋白的 Linewaver-Buck曲线 Fig.3Linewaver-Buck curves of BSA by Pyonin B under different temperatures.1： 25 2：35 表2 静态猝灭方程和相关系数R及结合位点数nTa

15、ble2 Static quenching equation and correlation coefficient r and the number of binding sites nT/KRegression equationRn298log(F0/F-1)=5.76356+1.18034logQ0.994541.18034308log(F0/F-1)=5.64523+1.19626logQ0.995801.19626根据实验结果，可知PB 对牛血清白蛋白之间有一定的结合作用，在298K和308K的条件下它们形成了一个结合位点，吡罗红B同牛血清白蛋白形成1:1的复合物。温度升高结合比有所

16、升高，说明生成复合物随温度升高而稳定。3.3 PB与BSA结合力类型的确定由热力学公式;lnK2/K1=H(1/T1-1/T2)/R （4）G=H-TS=-RTlnK （5） 求出热力学数据如表3表3热力学参数Table3 Thermodynamic parametersT/KH(kJ/mol)S(J/K)G(kJ/mol)298-130.72747.480-14.279308-130.72746.510-14.456 反应G0从热力学角度分析PB与BSA结合反应能够自发进行,反应的H0为放热反应。小分子和蛋白质等生物大分子的结合主要有疏水作用力、氢键、范德华力和静电引力等。由表3，可以看出反

17、应的焓变H0，可以判断其相互作用力主要为静电作用力。3.4吡罗红B对BSA紫外吸收光谱的影响图4 ：PB与BSA相互作用的紫外吸收光谱Fig4 UV-visible absorption spectra of PB,BSA and Pyronine B interaction with the BSA synchronousCBSA=1.010-6 molL-1 ; CPB=1.010-6molL-1;1:BSA-PB; 2:PB; 3:BSA；4:纯离子液相中由图4可知；PB的加入使BSA的吸光度明显增强，并在347和 533nm处有新的吸收峰，而单纯的BSA在此两处均没有吸收峰。表明PB和

18、BSA发生了相互作用。3.5吡罗红B对BSA构象的影响 蛋白质的荧光主要是色氨残基酸、酪氨酸残基，可利用同步荧光光谱法来分析PB对BSA的构象的影响。当=15时，同步荧光光谱显示酪氨酸残基的特征荧光，当=60时同步荧光光谱显示色氨残基酸的特征荧光，而色氨残基酸、酪氨酸残基的最大发射波长与它们各自所处的微环境直接有关，所以可根据 = 15的同步荧光光谱 和=60的同步荧光光谱来研究BSA的构象变化的情况。图5 PB与BSA相互作用的同步荧光光谱（=15）Fig5 Pyronine B interaction with the BSA synchronous fluorescence spectr

19、oscopy1-5:CBSA=1.010-6 molL-1； 1-5: CPB（1.010-6molL-1）=0，3，6 ，12，15；图6 PB与BSA相互作用的同步荧光光谱（=60）Fig 6 Pyronine B interaction with the BSA synchronous fluorescence spectroscopy1-5：CBSA=1.010-6 molL-1； 1-5： CPB（1.010-6molL-1）=0，3，6,，12，15；从图5图6，可知；当BSA的量一定时，随吡罗红B浓度的增加酪氨酸和色氨酸残基荧光强度不断降低，酪氨酸和色氨酸残基的最大发射波长没有明

20、显的移动 , 说明PB的加入对BSA 的构象影响不大。3.6 加入不同金属离子对BSA-PB体系的影响图7 不同金属离子与BSA-PB的紫外可见吸收光谱Fig7 Different metal ions and BSA-Pyronine B, UV-visible absorption spectraCBSA=1.010-6molL-1;CK+=CMn2+=CMg2+=CZn2+=CCu2+110-3molL-1;CPB=1.010-5molL-1； 1： BSA；2：BSA-PB； 3：BSA-PB- Mn2+ ；4： BSA -PB- K+；5： BSA -PB-Mg2+6:BSA-PB-

21、Zn2+;7:BSA-PB-Cu2+ 图 8不同金属离子对BSAPB的荧光光谱Fig 8 Different metal ions and BSA-Pyronine B fluorescence spectraCBSA=1.010-6molL-1；CK+=CMn2+=CMg2+=CZn2+=CCu2+110-3molL-1；CPB=1.010-5molL-11： BSA；2： BSA-PB -Mg2+ ；3： BSA -PB- K+ ；4： BSA-PB- Mn2+；5：BSA -PB -Zn2+；6： BSA-PB；7： BSA-PB-Cu2+；由图7可知：Cu2+、Mn2+、Zn2+、Mg

22、2+和K+各金属离子的加入均使BSA-PB体系的紫外可见吸光度增强，Cu2+的加入吸光度增强更明显；由图8可知：Mn2+、Zn2+、Mg2+和K+的加入使BSA-PB体系的荧光强度增强，而Cu2+ 的加入使BSA-PB体系的荧光强度明显降低，而且最大发射波长有明显蓝移现象。说明Cu2+对体系的影响相对较强。3.7 Cu2+对BSA和PB对BSA- Cu2+体系的影响Cu2+、Mn2+、Zn2+、Mg2+和K+的加入，使BSA-PB体系的吸光度增强，除Cu2+以外，其它金属离子对体系的荧光强度有增敏的作用。其中Cu2+的加入对体系影响最大，而且使体系荧光明显猝灭，而且使体系的最大发射波长蓝移。本

23、文又深入地讨论Cu2+对BSA和PB对BSA-PB体系的影响。 图 8 Cu2+与BSA作用的荧光光谱Fig 8 Cu2 + and BSA fluorescence spectroscopyCBSA=1.010-6molL-1； 1-7：CCu2+=1.010-3 molL-1；0， 3，6，9，12，15，18；由图8可知Cu2+对BSA有荧光猝灭作用，荧光猝灭随Cu2+的浓度增加而加强；最大发射波长明显蓝移。说明Cu2+与BSA相互作用形成复合物。 图 9 PB与 BSA-Cu2+体系作用的荧光光谱Fig 9 Pyronine B and BSA-Cu2 + system fluores

24、cence spectra1-8:CBSA=1.010-6molL-1； 2-8：CCu2+=510-4molL-1；CPB（1.010-6molL-1）=0，3，6，9，12，15，18；9：CCu2+=110-3molL-1 10：CCu2+=110-3molL-1，CPB=1.010-5molL-1； 如图9所示：9为Cu2+没有荧光峰，而且PB- Cu2+体系也没有荧光峰。由2与38比较，可知当固定BSA-Cu2+的量，随PB浓度的增加体系荧光强度不断降低，并且峰位蓝移，说明PB与BSA- Cu2+体系形成了复合物，发生了静态猝灭现象。 图 10 吡罗红B- BSA -Cu2+的紫外可

25、见光吸收光谱图 Fig 10 Pyronine B -BSA -Cu2 + UV VIS absorption spectraCBSA=1.010-6molL-1；Cu2+ =110-3molL-1；CPB=1.010-5molL-11:BSA - Cu2+-PB；2:BSA-Cu2+；3:BSA-PB；4:Cu2+-PB；5:PB；6：BSA；7:Cu2+如图10所示；5、6、7分别是PB、BSA、Cu2+ 紫外可见吸收光光谱。由3、2可知PB和 Cu2+的加入使BSA的吸光度增强。由2，6,7可知，在波长为350nm和 534nm处BSA -Cu2+，BSA，Cu2+均没有吸收峰，而PB在此均有吸收峰。由1可知PB的加入使BSA -Cu2+体系的吸光度明显增强而且峰位明显蓝移。并在350nm和 534nm处有新的吸收峰，表明PB和BSA-Cu2+发生了相互作用。4 .结论本文研究结果表明，吡罗红B和牛血清白蛋白相互作用形成复合物，引发静态猝灭；依据热力学参数与作用力的关系确定吡罗红B与牛血清白蛋白之间的主要作用力为静电作用。根据同步荧光探讨了吡罗红B对BSA构象的影响，得出吡罗红B对BSA构象的影响