分子生物学-2

1、 DNA重组和重组重组和重组DNA技术技术DNA Recombination and Recombinant DNA technologyvDNA重组重组（DNA recombination）是指不同）是指不同DNA分子断裂和连接而产生分子断裂和连接而产生DNA片段的交换并片段的交换并重新组合形成新重新组合形成新DNA分子的过程。分子的过程。v重组重组DNA技术技术（recombinant DNA technology）是指在体外将两个或两个以上是指在体外将两个或两个以上DNA分子重新组分子重新组合并在适当细胞中增殖形成新合并在适当细胞中增殖形成新DNA分子的过程。分子的过程。 第一节第一节自

2、然界自然界DNA重组和基因转移重组和基因转移DNA Recombination and Gene Transfer in NatureDNA重组重组同源重组同源重组 (homologous recombination)位点特异的重组位点特异的重组(site-specific recombination)转座重组转座重组(transposition recombination)接合作用接合作用 (conjugation)转化作用转化作用 (transformation)转导作用转导作用 (transduction) 发生在同源序列间的重组称为发生在同源序列间的重组称为同源重组同源重组(homol

3、ogous recombination)，又称又称基本重组基本重组（general recombination）。是最基本的。是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。段的交换。 以以E.coli的同源重组为例，了解同源重组机制的同源重组为例，了解同源重组机制的的Holliday模型模型一、同源重一、同源重组组是最基本的是最基本的DNA重重组组方式方式nHolliday模型的模型的4个关键步骤：个关键步骤： 两个同源染色体两个同源染色体DNA排列整齐；排列整齐；片段重组

4、体片段重组体(patch recombinant)拼接重组体拼接重组体(splice recombinant) 一个一个DNA的一条链断裂、并与另一个的一条链断裂、并与另一个DNA对应的对应的链连接，形成链连接，形成Holliday中间体；中间体； 通过分支移动产生异源双链通过分支移动产生异源双链DNA； Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA，分别为：，分别为：v参与细菌参与细菌DNA同源重组的酶有数十种，其中最同源重组的酶有数十种，其中最关键的是关键的是RecA蛋白蛋白、RecBCD复合物复合物和和RuvC蛋蛋白白。vRecBCD复合

5、物复合物具有三种酶活性，即依赖于具有三种酶活性，即依赖于ATP的核酸外切酶活性、可被的核酸外切酶活性、可被ATP增强的核酸内切增强的核酸内切酶活性以及需要酶活性以及需要ATP的解螺旋酶活性。的解螺旋酶活性。 vRecA蛋白蛋白可结合单链可结合单链DNA（ssDNA），形成），形成RecA-ssDNA复合物。复合物。 vRuvC有内切酶活性，能专一性识别有内切酶活性，能专一性识别Holliday连连接点，并有选择地切开同源重组体的中间体。接点，并有选择地切开同源重组体的中间体。 内切酶内切酶 (recBCD)DNA侵扰侵扰(recA)分支迁移分支迁移 (recA) 内切酶内切酶(recBCD)

6、DNA 连接酶连接酶5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 3 3 5 3 5 3 3 5 5 3 5 3 5 3 Holliday中间体中间体5 3 5 3 5 3 5 3 Holliday中间体中间体5 3 5 3 5 3 5 3 5 5 3 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 内切酶内切酶(ruvC)内切酶内切酶(ruvC) DNA连接酶连接酶 DNA连接酶连接酶片段重组体片段重组体拼接重组体拼接重组体二、

7、位点特异重组是发生在特异位点二、位点特异重组是发生在特异位点间的间的DNA整合整合 位点特异重组位点特异重组(site-specific recombination) 是由整合酶催化，在两个是由整合酶催化，在两个DNA序列的特异序列的特异位点间发生的整合。位点间发生的整合。噬菌体的整合酶识别噬菌体和宿主染噬菌体的整合酶识别噬菌体和宿主染色体的特异靶位点发生选择性整合；反转色体的特异靶位点发生选择性整合；反转录病毒整合酶可特异地识别、整合反转录录病毒整合酶可特异地识别、整合反转录病毒病毒cDNA的的长末端重复序列长末端重复序列(long terminal repeat, LTR)。 （一）（一）

8、噬菌体噬菌体DNA的整合的整合（二）免疫球蛋白基因的重排（二）免疫球蛋白基因的重排 免疫球蛋白免疫球蛋白(Ig)，由两条轻链，由两条轻链(L链链)和两条重和两条重链链(H链链)组成，分别由三个独立的基因族编码，组成，分别由三个独立的基因族编码，其中两个编码轻链其中两个编码轻链( 和和 )，一个编码重链。，一个编码重链。 轻链的基因片段：轻链的基因片段：重链的基因片段：重链的基因片段：L V J C L V D J C 重链重链(IgH)基因的基因的V-D-J重排和轻链重排和轻链(IgL)基基因的因的V-J重排均发生在特异位点上。在重排均发生在特异位点上。在V片片段的下游，段的下游，J片段的上游

9、以及片段的上游以及D片段的两侧片段的两侧均存在保守的重组信号序列均存在保守的重组信号序列(recombination signal sequence, RSS)。此重排的重组酶基。此重排的重组酶基因因rag (recombination activating gene)共有共有两个，分别产生蛋白质两个，分别产生蛋白质RAG1和和RAG2。 CACAGTG(12/23)ACAAAAACCGTGTCCAC TGTTTTTGG重组信号序列重组信号序列基因片段基因片段免疫球蛋白基因重排过程免疫球蛋白基因重排过程三、转座重组三、转座重组可使基因移位可使基因移位 由插入序列和转座子介导的基因移位或重由插入

10、序列和转座子介导的基因移位或重排称为排称为转座转座(transposition)。 大多数基因在基因组内的位置是固定的，大多数基因在基因组内的位置是固定的，但有些基因可以从一个位置移动到另一位但有些基因可以从一个位置移动到另一位置。这些可移动的置。这些可移动的DNA序列包括插入序序列包括插入序列和转座子。列和转座子。 插入序列插入序列(insertion sequences, IS)组成：组成：IRTransposase GeneIR（一）插入序列（一）插入序列转转座座 二个分离的反向重复二个分离的反向重复(inverted repeats, IR)序列序列 特有的正向重复序列特有的正向重复序

11、列 一个转座酶（一个转座酶（transposase)编码基因编码基因插入序列的复制性转座插入序列的复制性转座 转座子转座子(transposons) 可从一个染色体可从一个染色体位点转移到另一位点的分散重复序列。位点转移到另一位点的分散重复序列。IRIRTransposase Gene有用基有用基因因（二）（二）转转座子座子转转座座转座子组成：转座子组成： 反向重复序列反向重复序列转座酶编码基因转座酶编码基因抗生素抗性等有用的基因抗生素抗性等有用的基因 细菌的可流动性元件细菌的可流动性元件A插入序列：转座酶编码基因两侧连接反向末端重复序列插入序列：转座酶编码基因两侧连接反向末端重复序列(箭头所

12、示箭头所示)B转座子转座子Tn3：含有转座酶、：含有转座酶、-内酰胺酶及阻遏蛋白编码基因内酰胺酶及阻遏蛋白编码基因C转座子转座子Tn10：含四环素抗性基因及两个相同的插入序列：含四环素抗性基因及两个相同的插入序列IS10L由转座子介导的转座由转座子介导的转座Barbara McClintock (19021992)DNA transposable elementNobel Prize in Physiology or Medicine 1983第二节第二节 重组重组DNA技术技术Recombinant DNA Technology重组重组DNA技术的发展史技术的发展史1865年年 G.J.Me

13、ndel的豌豆杂交试验。的豌豆杂交试验。1944年年 O.T.Avery的肺炎球菌转化实验。的肺炎球菌转化实验。1973年年 美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子。分子。1977年年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组工程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的技术制造医学上重要的药物。药物。1980年年 开始建造第一家应用重组开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂。技术生产胰岛素的工厂。1997年年 英国罗林研究所成功的克隆了多莉。英国罗林研究所成功的克

14、隆了多莉。重组重组DNA技术相关概念技术相关概念 克隆克隆(clone):来自同一始祖的相同副本或拷来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。贝的集合。 获取同一拷贝的过程称为克隆化获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。，即无性繁殖。 DNA克隆克隆 技术水平：技术水平：分子克隆分子克隆(molecular clone) （即（即DNA 克隆）克隆） 细胞克隆细胞克隆 个体克隆（动物或植物）个体克隆（动物或植物）Dolly(19962003)Dolly and Bonnie1996, First mammal cloned from adult cells其主要过程包括：在体外

15、将目的其主要过程包括：在体外将目的DNA片段与能自片段与能自主复制的遗传元件（又叫载体）连接，形成重组主复制的遗传元件（又叫载体）连接，形成重组DNA分子，进而在受体细胞中复制、扩增，从而获得单一分子，进而在受体细胞中复制、扩增，从而获得单一DNA分子的大量拷贝。分子的大量拷贝。重组重组DNA技术，又称分子克隆（技术，又称分子克隆（molecular cloning）或）或DNA克隆（克隆（DNA cloning）或基因工）或基因工程（程（genetic engineering）技术）技术 目的：目的： 分离获得某一感兴趣的基因或分离获得某一感兴趣的基因或DNA 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白

16、质）获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）一、重组一、重组DNA技术中常用的工具酶技术中常用的工具酶 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 DNA聚合酶聚合酶 逆转录酶逆转录酶 T4DNA连接酶连接酶 碱性磷酸酶碱性磷酸酶 末端转移酶末端转移酶 Taq DNA聚合酶聚合酶 for the discovery of restriction enzymes and their application to problems of molecular geneticsWerner Arber Daniel Nathans Hamilton O. Smith Switzerland Biozentrum de

17、r Universitt Johns Hopkins University School of Medicine Baltimore, USA Johns Hopkins University School of Medicine Baltimore, USA （1929 ）（1928 1999）（1931 ） 发现限制与修饰现象；分离出I型内切酶分离出II型内切酶用II型内切酶切割DNANobel Prize in Physiology or Medicine 1978重组重组DNA技术中常用的工具酶技术中常用的工具酶工工 具具 酶酶功功 能能限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶识别特异序列，切

18、割识别特异序列，切割DNADNA连接酶连接酶催化催化DNA中相邻的中相邻的5 磷酸基和磷酸基和3 羟基末端之间形成磷酸羟基末端之间形成磷酸二酯键，使二酯键，使DNA切口封合或使两个切口封合或使两个DNA分子或片段连接分子或片段连接DNA聚合酶聚合酶合成双链合成双链cDNA分子或片段连接；分子或片段连接；缺口平移制作高比缺口平移制作高比活探针；活探针； DNA序列分析；序列分析；填补填补3 末端末端Klenow片段片段又名又名DNA聚合酶聚合酶I大片段，具有完整大片段，具有完整DNA聚合酶聚合酶I的的53 聚合、聚合、35 外切活性，而无外切活性，而无53 外切活性。常用于外切活性。常用于cDN

19、A第二链合成，双链第二链合成，双链DNA 3 末端标记等末端标记等反转录酶反转录酶合成合成cDNA；替代替代DNA聚合酶聚合酶I进行填补，标记或进行填补，标记或DNA序列分析序列分析多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5 羟基末端磷酸化，或标记探针羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶末端转移酶在在3 羟基末端进行同质多聚物加尾羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶碱性磷酸酶切除末端磷酸基切除末端磷酸基限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restriction endonuclease) 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)

20、是一类核酸内切酶，能识别双链是一类核酸内切酶，能识别双链DNA分子分子内部的特异序列内部的特异序列, 并裂解磷酸二酯键。并裂解磷酸二酯键。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBam H定定义义： ：与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源系统，限制外源DNA，保护自身，保护自身DNA。、（基因工程技术中常用（基因工程技术中常用型）型） 分分类类： ： 作用：作用：第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；

21、第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。用罗马数字表示发现的先后次序。 命名：命名：Hin d 属属 系系 株株 序序Haemophilus influenzae d株株流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌d株的第三种酶株的第三种酶类酶识别序列特点类酶识别序列特点 回文结构回文结构(palindrome) 切口切口 ：平端切口平端切口、粘端切口粘端切口Bam HGTCCAGGCCTAGGATCC GGGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG平端切口平端切口黏端切口黏端切口有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割但切割DNA后，

22、产生相同的粘性末端，称为同尾后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性 末 端 称 为 配 伍 末 端酶。这两个相同的粘性 末 端 称 为 配 伍 末 端(compatible end)。 GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC GATCTAG GATCT A 同尾同尾酶酶来源不同的限制酶，但能识别和切割同一来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称位点，这些酶称同裂酶或同功异源酶同裂酶或同功异源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBam HGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBst同裂同裂酶酶： ：名称

23、名称 识别序列及切割位点识别序列及切割位点名称识别序列及切割点名称识别序列及切割点切割后产生切割后产生突出末端突出末端:BamH 5GGATCC.3GATCC.3Bgl 5AGATCT.3GATCT.3EcoR EcoR 5GAATTC.3AATTC.3Hind Hind 5AAGCTT.3AGCTT.3 Hpa Hpa 5CCGG.3CGG.3 Mbo Mbo 5GATC.3GATC.3 Nde Nde 5GATATG.3TATG.3切割后产生切割后产生3突出末端突出末端:Apa 5GGGCCC.3C.3Hae 5PuGCGCPy.3Py.3Kpn 5GGTACC.3C.3Pst 5CTGC

24、AG.3G.3Sph 5GCATGC.3C.3切割后产生平末端切割后产生平末端:Alu 5AGCT.3CT.3EcoR 5GATATC.3ATC.3Hae Hae 5GGCC.3CC.3Pvu Pvu 5CAGCTG.3CTG.3Sma Sma 5CCCGGG.3GGG.3 限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶 二、重组二、重组DNADNA技术中常用的载体技术中常用的载体 定义定义为携带目的基因，实现其无性繁殖为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。分子。 载体按功能分为载体按功能分为 克隆载体克隆载体(cloning vector

25、) 表达载体表达载体(expression vector) 克隆载体克隆载体(cloning vector)为使插入的外源为使插入的外源DNA序列被扩增而特意序列被扩增而特意设计的载体称为设计的载体称为克隆载体克隆载体。 表达载体表达载体(expression vector) 为使插入的外源为使插入的外源DNA序列可转录翻译成序列可转录翻译成 多肽链而特意设计的多肽链而特意设计的载体称为载体称为表达载体表达载体。（一）克隆载体（一）克隆载体 至少有一个复制起点使载体在宿主细胞中进行至少有一个复制起点使载体在宿主细胞中进行自主复制自主复制，并能使克隆的外源并能使克隆的外源DNA片段得到同步扩增；

26、片段得到同步扩增； 至少有至少有一个选择标志一个选择标志（selection marker）：选择标志是）：选择标志是区分含与不含载体的细胞所必需的，包括抗生素抗性基区分含与不含载体的细胞所必需的，包括抗生素抗性基因、因、-半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（lacZ）、营养缺陷耐受基因等。）、营养缺陷耐受基因等。 有适宜的有适宜的RE的单一切点的单一切点：载体中一般都构建有一段特异：载体中一般都构建有一段特异性核苷酸序列，在这段序列中包含了多个性核苷酸序列，在这段序列中包含了多个RE的单一切点，的单一切点，可供外源基因插入时选择，叫多克隆位点（可供外源基因插入时选择，叫多克隆位点（multipl

27、e cloning sites，MCS）。）。1. 1. 克隆载体应具备的基本特点克隆载体应具备的基本特点 （1 1）质粒）质粒 (plasmid)特点特点: : 能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息传信息, , 会赋予宿主细胞一些遗传性状。会赋予宿主细胞一些遗传性状。 2. 常用的克隆载体常用的克隆载体 pUC18质粒载体图谱质粒载体图谱 噬菌体噬菌体DNA改造系统改造系统 gt系列（插入型，适用系列（插入型，适用cDNA克隆）克隆） EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）系列（置换型，适用基因组克隆）（2 2）噬菌体）噬菌体(phage) M1

28、3噬菌体噬菌体DNA改造系统（含改造系统（含lacZ基因）基因） M13mp系列系列 pUC系列系列柯斯质粒柯斯质粒（cosmid）载体（又称黏粒载体）载体（又称黏粒载体） 酵母人工染色体酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC) 细菌人工染色体细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC) 动物病毒动物病毒DNA改造的载体改造的载体 （如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）（ （3）其他克隆）其他克隆载载体体（二）表达载体（二）表达载体表达载体是指用来在宿主细胞中表

29、达外源基因表达载体是指用来在宿主细胞中表达外源基因的载体。的载体。根据宿主细胞分为：根据宿主细胞分为：原核表达载体原核表达载体真核表达载体真核表达载体1. 1. 原核表达载体原核表达载体 原核表达载体的基本组成原核表达载体的基本组成 R R：调节序列；：调节序列；P P：启动子；：启动子；SDSD：SDSD序列；序列；TTTT：转录终止序列：转录终止序列2. 2. 真核表达载体真核表达载体 真核表达载体的基本组成真核表达载体的基本组成 OriPro：原核复制起始序列；P：启动子；MCS：多克隆位点； TT：转录终止序列；orieuk：真核复制起始序列。第三节第三节重组重组DNA技术基本原理技术

30、基本原理和操作步骤和操作步骤 基本原理基本原理目的基因的获取目的基因的获取DNA导入受体细胞导入受体细胞外源基因与载体的连接外源基因与载体的连接克隆载体的选择和构建克隆载体的选择和构建重组体的筛选重组体的筛选克隆基因的表达克隆基因的表达 以以 质质 粒粒 为为 载载 体体 的的DNA 克克 隆隆 过过 程程原核基因组和真核基因组原核基因组和真核基因组v真核生物基因组远远大于原核生物的基因组，真核生物基因组远远大于原核生物的基因组，结构复杂，基因数庞大，具有许多复制起始点结构复杂，基因数庞大，具有许多复制起始点，每个复制子大小不一，每个复制子大小不一v人类染色体单倍体人类染色体单倍体DNADNA

31、全长全长3 310109 9bpbp，含，含3 3 4 4万万个基因。个基因。v大肠杆菌大肠杆菌DNADNA全长全长4.64.6 10106 6bpbp，含，含40004000个基因。个基因。原核基因组原核基因组 Prokaryote Genome Prokaryote Genome 基因组通常仅由基因组通常仅由基因组中基因组中。基因组中的重复序列很少，编码蛋白质结构基因多为基因组中的重复序列很少，编码蛋白质结构基因多为单拷贝。单拷贝。启动子（启动子（promoterpromoter）、操纵基因）、操纵基因（operatoroperator）、调控序列、结构基因（）、调控序列、结构基因（str

32、ucture structure genegene）、终止子（）、终止子（terminatorterminator）。）。连续密码区连续密码区 mRNA Protein mRNA Protein 基本结构：基本结构：指能转录成为指能转录成为mRNAmRNA、rRNArRNA或或tRNAtRNA的的DNADNA顺序。顺序。结构基因不连续，编码序列被非编码序列打断，结构基因不连续，编码序列被非编码序列打断，分割成几段，分割成几段，编编码序列称为外显子码序列称为外显子(exon)(exon)，其间的序列称为内含子其间的序列称为内含子(intron),称为称为 非编码区非编码区 剪切剪切 编码区编码区

33、 编码区编码区 mRNA Protein 真核基因组真核基因组 Eukaryote Genome Eukaryote Genome intronexonexon有大量重复序列有大量重复序列 获取目的基因 聚合酶链反应聚合酶链反应（polymerase chain polymerase chain reaction, PCRreaction, PCR）是在体）是在体外进行的由引物介导的外进行的由引物介导的酶促酶促DNADNA扩增反应。是获扩增反应。是获取已知序列候选基因的取已知序列候选基因的主要方法。主要方法。基因重组基因重组v基因操作的关键步骤和核心内容基因操作的关键步骤和核心内容v关系到研究

34、的成败或质量关系到研究的成败或质量v包括：基因分离，基因组合，基因转化，基因筛包括：基因分离，基因组合，基因转化，基因筛选选 （三）目的（三）目的DNA与载体连接与载体连接方式：（方式：（1）单一相同黏端连接单一相同黏端连接 （2 2）不同黏端连接不同黏端连接 （3）通过其他措施产生黏端进行连接通过其他措施产生黏端进行连接 黏端黏端连连接接Bam H切割反应切割反应 GGATCC CCTAGGT4 DNA连接酶连接酶15CGATCC GGCCTAG目的基因用目的基因用 Bam H切割切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG载体载体DN

35、A用用Bam H切割切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG重组体重组体GCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCG载体自连载体自连目的基因自连目的基因自连单一相同黏端连接单一相同黏端连接不同黏端连接（定向克隆）不同黏端连接（定向克隆）GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTAGAATTCCTTAAGAGATCTTCTAGAEco R切割位点切割位点Bg l切割位点切割位点AATTCGATCTAGAATTCGGATCTAAATTCGATCTAGEcoR+ Bg l双酶切双酶切E

36、co R+ Bg l双酶切双酶切GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTAT4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体由平端加上新的酶切位点，再用限制由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。 人工接人工接头头(linker)连连接接通过其他措施产生黏端进行连接通过其他措施产生黏端进行连接在末端转移酶在末端转移酶(terminal transferase) 的作的作用下，在用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。造出粘性末端，再进行粘端连接。 同聚物加尾同聚物加尾连连接接5

37、3 3 5 载体载体DNA5 3 3 5 目的基因目的基因限制酶或机械剪切限制酶或机械剪切限制酶限制酶 5 3 3 5 5 3 T(T)nT T(T)nT 3 5 5 3 3 5 3 A(A)nA A(A)nA 3 5 -核酸外切酶核酸外切酶-核酸外切酶核酸外切酶末端转移酶末端转移酶+ dATP末端转移酶末端转移酶+ dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nA T(T)nTT4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体5 PCR法加入法加入RE位点位点针对目的针对目的DNADNA的的5 5 - -和和3 3 - -端，设计一对特异引物，端，设计一对特异引物，在每条引物的在每条引物的5 5 - -

38、端分别加上不同的端分别加上不同的RERE位点，然位点，然后以目的后以目的DNADNA为模板，经为模板，经PCR PCR 扩增便可得到带扩增便可得到带有引物序列的目的有引物序列的目的DNADNA，再用相应，再用相应RERE切割切割PCRPCR产物，产生黏端，随后便可与带有相同黏端的产物，产生黏端，随后便可与带有相同黏端的线性化载体进行有效连接。线性化载体进行有效连接。 平端连接平端连接 限制性内切酶切割产生的平端限制性内切酶切割产生的平端粘端补齐或切平形成的平端粘端补齐或切平形成的平端适用于：适用于：目的基因目的基因载体载体限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶T4 DNA连接酶连接酶

39、15C重组体重组体载体自连载体自连目的基因目的基因 自连自连3. 3. 粘粘- -平末端连接平末端连接v黏黏- -平末端连接是指目的平末端连接是指目的DNADNA和载体之间通过和载体之间通过一端为黏端、另一端为平端的方式进行连接。一端为黏端、另一端为平端的方式进行连接。 v属于定向克隆属于定向克隆受体菌条件：受体菌条件：安全宿主菌安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷限制酶和重组酶缺陷处于感受态处于感受态(competent) 导入方式：导入方式：转化转化 (transformation)转染转染 (transfection)感染感染 (infection)（四）重（四）重组组DNA转转入受体入受体细

40、细胞胞转转1. 借助载体上的遗传标志进行筛选借助载体上的遗传标志进行筛选 (1) 利用抗生素抗性标志筛选利用抗生素抗性标志筛选(2) 利用基因的插入失活利用基因的插入失活/插入表达特性筛选插入表达特性筛选(3) 利用标志补救筛选利用标志补救筛选(4)利用噬菌体的包装特性进行筛选利用噬菌体的包装特性进行筛选（五）重（五）重组组体的体的筛选筛选与与鉴鉴定定筛筛2. 序列特异性筛选序列特异性筛选 (1) RERE酶切法酶切法(2) PCR法法 (3) 核酸杂交法核酸杂交法(4) DNA测序法测序法 3. 亲和筛选法亲和筛选法插入失活筛选带有重组载体的克隆插入失活筛选带有重组载体的克隆 互补筛选（蓝互

41、补筛选（蓝- -白筛选）白筛选） 菌落或噬斑原位杂交筛选重组体菌落或噬斑原位杂交筛选重组体 重组重组DNADNA技术操作过程可形象归纳为：技术操作过程可形象归纳为： 小结小结分分分离获取目的基因分离获取目的基因 选选载体的选择与构建载体的选择与构建接接目的目的DNADNA与载体连接与载体连接 转转重组重组DNADNA转入受体细胞转入受体细胞筛筛重组体的筛选与鉴定重组体的筛选与鉴定表达体系的建立：表达体系的建立： 表达载体的构建表达载体的构建 受体细胞的建立受体细胞的建立 表达产物的分离纯化表达产物的分离纯化（六）克隆基因的表达（六）克隆基因的表达 标准：标准：选择标志选择标志 强启动子强启动子 翻译调控序列翻译调控序列多接头克隆位点多接头克隆位点 E.coli表达体系的不足表达体系的不足：不宜表达真核基因组不宜表达真核基因组DNA；不能加工表达的真核蛋白质；不能加工表达的真核蛋白质；表达的蛋白质常形成不溶性包涵