几种牛奶在不同阶段菌落总数的变化规律及应对措施分析

1、实验整体计划实验整体计划菌落总数规律测定 大肠菌群最可能数（MPN）测定 嗜冷菌菌落总数的检测 样品一周范围内pH变化状况检测 （一）菌落总数规律测定（一）菌落总数规律测定 实验原理：实验原理： 菌落总数是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后（如培养基成分、培养温度和时间、pH、需氧性质等），所得1g（或1mL）检样中所含菌落的总数。菌落总数主要作为判定食品被污染程度的标志，也可以应用这一方法观察细菌在食品中繁殖的动态，以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。 在实际工作中，一般都只用一种常用的方法平板活菌计数法，此法测出的结果较为精确。 实验步骤：实验步骤：1. 样品稀释。样品稀释。以无菌

2、操作, 取1mL无菌吸管作10倍递增稀释。共取1：10，1：100，1：1000三个稀释度。每递增稀释度一次，即换用1支1mL灭菌吸管。2. 接种。接种。无菌操作，在做10倍递增稀释液的同时，吸取该稀释度的吸管移取1mL稀释液于灭菌平皿中，每个稀释度做两个平行样。及时将46左右的琼脂培养基注入平皿约15mL, 混合均匀。3.培养。培养。待琼脂凝固后，反转平皿,倒置于361温箱内进行培养，482小时取出,计算平板内菌落数目,乘以稀释倍数,即为每克(或毫升)样品所含菌落总数。实验结果记录实验结果记录（1）表）表1 1414日，放置日，放置0 0天，第一次接种培养天，第一次接种培养4848小时菌落计

3、数结果小时菌落计数结果 样品编号报告方式(cfu/g或ml) 平均值(cfu/g或ml) L1（龙丹）2.51041.6104L2（龙丹） 7.9103M1（蒙牛） 1010M2（蒙牛） 10G1（广泽） 1.91031.0103G2（广泽） 1.8102H1（辉山） 6050H2（辉山） 40 表表2 162 16日，放置日，放置2 2天，第二次接种培养天，第二次接种培养4848小时菌落计数结果小时菌落计数结果 样品编号报告方式(cfu/g或ml)平均值(cfu/g或ml)L1（龙丹） 41042.4105L2（龙丹） 4.3105M1（蒙牛）3.21042.1104M2（蒙牛）9103G1

4、（广泽） 41041.8105G2（广泽）3.2105H1（辉山） 4.11043.2104H2（辉山）2.3104 表表3 183 18日，放置日，放置4 4天，第三次接种培养天，第三次接种培养4848小时菌落计数结果小时菌落计数结果 样品编号报告方式(cfu/g或ml)平均值(cfu/g或ml)L1（龙丹） 2.41052105L2（龙丹） 1.6105M1（蒙牛）8.21048.7104M2（蒙牛）9.1104G1（广泽） 3.21043.9104G2（广泽）4.6104H1（辉山） 7.91068.6106H2（辉山）9.2106 表表4 4 经过煮沸后，第四次接种培养经过煮沸后，第四

5、次接种培养4848小时菌落计数结果小时菌落计数结果 样品编号报告方式(cfu/g或ml)平均值(cfu/g或ml)L1（龙丹） 1.61038.5102L2（龙丹） 1102M1（蒙牛）401.7102M2（蒙牛）3102G1（广泽） 1015G2（广泽）20H1（辉山） 7070H2（辉山）70组图组图1 菌落生长情况示例菌落生长情况示例 细菌种类列举分析：细菌种类列举分析： 通过四次菌落培养，我们可以观察到除了明显的大肠菌群菌落外，还有其他几种形态的菌落，包括齿状边缘中间有褶皱的菌落，以及半透明状光滑边缘菌落等，经涂片镜检后可观察到不同形态，现将两种出现数量较多的菌落在镜下的图片做以示例。

6、 从两个示例图片显示的细菌形态上来看，第一个称短杆状，菌体内部有液泡，第二种明显属于杆菌类，初步推断二者均为肠杆菌属。为进一步判断，将两种菌落分别挑取少许做乳糖胆盐发酵实验，361恒温培养24小时后观察，发现试管内没有变色，U形小管内也没有气泡产生，所以该两种菌均没有产酸产气，不属于肠杆菌属。所以可能是其它杆菌属。图图1 1 齿状边缘中心有褶皱的菌落齿状边缘中心有褶皱的菌落图图2 2 半透明状边缘光滑菌落半透明状边缘光滑菌落 表表5 四次菌落计数结果对比四次菌落计数结果对比 放置0天 放置2天放置4天煮沸后L(龙丹)1.61042.410521058.5102M(蒙牛)102.11048.71

7、041.7102G(广泽)1.01031.81053.910415H(辉山) 503.21048.610670 实验结果分析：实验结果分析： 国际标准巴氏杀菌奶(GB5408.1-1999)的菌落总数指标应该是30000 cfu/g（mL） 综合上述结果我们可以看到，刚刚开袋的牛奶全部达标，当几种样品敞口在空气中放置2天后，菌落总数全部明显增加，几种样品菌落总数全部超标。由此可以推出结论，纯牛奶在空气中放置时，由于牛奶本身营养十分丰富，是天然的培养基，所以在此期间牛奶中细菌大量繁殖，短短几天内菌落总数的增长已经达到了无法计数的超标，最后做的一次煮沸实验看到，经过高温加热，菌落总数已经大大减少，

8、甚至已经达标。可见加热对已被污染的牛奶是有良好灭菌效果的。 所以日常生活中牛奶切勿敞口放置在空气中，对已经搁置一段时间的牛奶，虽然经过煮沸也可以安全食用，但若经过多次此类加工，其营养成分和风味也会大打折扣，失去了本来的价值。所以建议尽量不要把纯牛奶暴露在空气中放置，开袋后要立即饮用。（二）大肠菌群最可能数（大肠菌群最可能数（MPNMPN）测定）测定 实验原理：实验原理： 大肠菌群是一群（在37，24h）能分解乳糖产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。它包括埃希氏菌属、枸橼酸菌属、肠杆菌属（又叫产气杆菌属，包括阴沟肠杆菌和产气肠杆菌）、克雷伯氏菌属中的一部分和沙门氏菌属的第亚属（能发酵

9、乳糖）的细菌。 大肠菌群主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，具有广泛的卫生学意义。它反映了食品是否被粪便污染，同时间接地指出食品是否有肠道致病菌污染的可能性。 食品中大肠菌群数是以每100mL（或100g）检样内大肠菌群最可能数（The most probable number,简称MPN）表示。 实验方法实验方法 检样稀释的方法与上一个菌落总数实验相同，此次实验也是检验刚开袋的巴氏灭菌奶大肠菌群值，首先要验证牛奶中是否会长出大肠菌群的菌落，所以要先经过与前一实验相同的几大步骤，同样第一次菌落计数做的是刚刚开袋的巴氏灭菌纯牛奶，因此稀释梯度设置为从1：10到1：10

10、00，一共是4个样品，每个稀释梯度做两个平行参照。 因为最后做出结果，平皿中有长出疑似大肠菌群的菌落，于是进入下一步乳糖发酵实验进行检验。 乳糖发酵实验乳糖发酵实验 本实验接种为0.1mL，在1mL以下，所以使用单料乳糖胆盐发酵管。 选取三个稀释度，每个稀释度准备接种3管乳糖胆盐发酵管。 本次选取的稀释度为1：10，1：100和1：1000，四个样品，最后接种36支试管，将标签贴好后准备24小时后观察记录结果。 接种完毕后，置361温箱内进行培养，培养242小时，如所有发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，如有产气者，则进行分离培养。 经过培养经过培养24242 2小时后，发现小时后，发现3

11、636支试管均未产支试管均未产气，也未变色，气，也未变色，组图组图3 3 乳糖胆盐发酵管接种样品后培养乳糖胆盐发酵管接种样品后培养24242 2小时后的结果小时后的结果 验证乳糖胆盐发酵管是否有效实验验证乳糖胆盐发酵管是否有效实验 方法：方法：在36支试管中挑取了两支试管，并接种大肠菌群活菌，后放置361温箱内进行培养，如若试管内有产酸产气现象，即溶液颜色变黄，小倒管中有气泡产生。 结果：结果：培养24小时后，将2支试管取出观察，可以明显看到试管中溶液颜色变黄，并且小倒管中有气泡，如下图（图2-3）所示。所以经验证证明，此次配置的乳糖胆盐发酵管的确有效。即36支试管可以报告大肠菌群阴性。图图4

12、 4 相同相同的乳糖胆盐发酵的乳糖胆盐发酵管接种管接种大肠菌群活菌培养大肠菌群活菌培养2424小时小时后变色结果后变色结果 实验结果与讨论实验结果与讨论 通过本次实验可以看出，四种样品在大肠菌群检验乳糖胆盐发酵管过程中均无产酸产气现象，初步判定大肠菌群阴性，每个稀释度的三支试管阳性管数都为零，即每个样品的9支试管中没有阳性管。 通过查阅大肠菌群的最可能数（MPN）检索表，可知此四种样品每100mL样品大肠菌群的最可能数（MPN）均为30。可见这四种样品在生产和包装过程中基本没有受到大肠菌群的污染，安全生产控制较为严格，灭菌效果较好。说明目前各生产厂家在处理大肠菌群污染上已经具备比较完善的措施，

13、此项指标比较容易达到。 （三）牛奶中嗜冷菌菌落总数的检测牛奶中嗜冷菌菌落总数的检测 实验原理实验原理嗜冷菌(Psychrophiles)就是指那些最适生长温度等于或低于15，上限温度等于或低于20的微生物的总称1。目前食品微生物专家广泛接受的嗜冷菌的概念是：07下能够生长，并在710 d内产生可见菌落的微生物。嗜冷菌在低温环境下能够生长，给低温贮藏食品带来一定的困难。嗜冷菌污染是影响保质期的主要因素。嗜冷菌的种类繁多,广泛存在于低温环境中。在已经了解的嗜冷菌中,细菌就有30多个属,常见如假单胞菌属、产碱杆菌属、无色杆菌属、黄杆菌属、克雷伯氏菌属。嗜冷菌在低温冷藏时会大量繁殖,虽然这些细菌经过加

14、热可被杀死,但它们中的某些菌属如假单胞菌属可产生极其耐热的蛋白酶和脂肪酶,这些酶即使在经过140(2 min)的处理,仍会有10%的残留。在条件为2025时可以在一定培养基上生长，生长57天即可计数。在此温度下只适合嗜冷菌的生长，因此只要有菌落生成，则证明该样品中含有嗜冷菌。 实验步骤实验步骤 样品稀释及培养：以无菌操作,将检样1mL放入装有9mL无菌水的大试管内,经充分振摇成110的均匀稀释液。用1mL无菌吸管吸取110稀释液1mL,沿瓶壁注入含有9mL无菌水的试管内,振荡试管混合均匀,使成1100稀释液。另取1mL无菌吸管按上述程序作10倍递增稀释。接种用1mL无菌吸管吸取1mL稀释液,注

15、入平皿。及时将46左右的培养基注入平皿约15mL,并左右转动平皿使混合均匀。另将营养琼脂培养基倾入加有1mL无菌水(不含样品)的灭菌平皿内做空白对照。 将涂布好的培养皿放置在20左右的环境下培养，待7天后来观察实验结果。 实验结果与讨论实验结果与讨论 在20左右环境下，通过7天培养，培养皿中已有一定数量菌落生长，下表做了此次实验四种样品嗜冷菌的菌落总数计数。 表表6 206 20培养培养7 7天，四种样品嗜冷菌菌落计数结果天，四种样品嗜冷菌菌落计数结果 样品编号报告方式(cfu/g或ml)平均值(cfu/g或ml)L1（龙丹） 2.71032.1103L2（龙丹） 1.4103M1（蒙牛）9.

16、31021.0103M2（蒙牛）1.1103G1（广泽） 2.61031.9103G2（广泽）1.2103H1（辉山） 1.11031.6103H2（辉山）2.2103 实验结果分析实验结果分析 检测结果虽然显示菌落总数没有超标，但相比第一步嗜温菌菌落总数检测的结果，嗜冷菌的数据不是很乐观，我们可以看出，即使在低温密封条件下，放置几天的袋装奶嗜冷菌菌数还是有继续增长的可能，而一般这种密封袋装奶的保质期都为一个月，并且要求避光低温保存，在这样的条件下嗜冷菌依然容易大量生长，时间越长数量越多，到最后可能会达到临界超标的数值。 另外，嗜冷菌会产生耐热酶，不论是加热还是超高温灭菌，都不能彻底消灭嗜冷菌

17、，因此消费者应注意选择生产日期离当天日期较近的牛奶，这样更能保证食用安全。而对于牛奶生产厂家和研究机构，还应尽快研究出一种有效的彻底灭嗜冷菌的方法，以保证食用更安全，保质期也可能相应延长。（四）纯牛奶一周范围内（四）纯牛奶一周范围内pHpH变变化状况检测化状况检测 实验目的及方法：实验目的及方法： 纯牛奶在储存过程中，它的pH是不断变化的，为了观察一周之内牛奶酸度变化，判断是否对实验结果有一定影响，此次实验进行了牛奶中pH的检测。 本次检测使用PHS-3C型酸度计。酸度计简称pH计，由电极和电计两部分组成。使用中若能够合理维护电极、按要求配制标准缓冲液和正确操作电计,可大大减小pH示值误差。

18、首先使用缓冲溶液进行标定。主要标定两个校准点。pH：4.0；pH：6.86。校正完毕后进行测量。测量对象依然是四个样品，从第二天起四个样品均敞口放置。一共测量7天，每天一次，最后总结数据。 表表7 77 7天的检测后得出实验结果天的检测后得出实验结果 批次及对应结果批次及对应结果 一一二二三三四四五五六六七七L6.86 6.89 6.98 7.01 7.20 6.96 7.11M6.68 6.66 6.71 6.73 6.74 6.75 6.72G6.51 6.53 6.54 6.55 6.77 6.94 6.63H6.77 6.78 6.82 6.82 6.95 6.82 6.76 四种样品四种样品7 7天内天内pHpH变化情况变化情况 折线图折线图 结果分析：结果分析： 从线性图表中可以看出，四个样品从线性图表中可以看出，四个样品7天的天的pH值值呈现微弱的变化，先是升高，后再降低，相比呈现微弱的变化，先是升高，后再降低，相比之下变化较明显的是广泽牛奶，而蒙牛牛奶几之下变化较明显的是广泽牛奶，而蒙牛牛奶几乎是呈直线变化的。乎是呈直线变化的。 虽然图表显示几种样品都呈相似的规律变化，虽然图表显示几种样品都呈相似的规律变化，但是