大实验五 发酵罐认知及链霉素发酵

1、大实验五大实验五 发酵罐认知及链霉素发酵发酵罐认知及链霉素发酵 1 1、认识掌握机械搅拌通风发酵罐结构组成、认识掌握机械搅拌通风发酵罐结构组成 2 2、学习机械搅拌通风发酵罐使用方法、学习机械搅拌通风发酵罐使用方法 3、了解链霉素发酵工艺过程及抗菌活性测定方法了解链霉素发酵工艺过程及抗菌活性测定方法 实验目的要求实验目的要求实实 验验 原原 理理 The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1952for his discovery of streptomycin, the first antibiotic effective against tuber

2、culosis Selman Abraham Waksman USA Rutgers University New Brunswick, NJ, USA b. 1888(in Priluka, Ukraine, Russia实验原理 (continued)Filamentous bacteria which produces the antibiotic, Streptomycin实验原理 (continued)抗菌活性测定抗菌活性测定实验原理 (continued)滤纸片法滤纸片法 琼脂挖井法琼脂挖井法实实 验验 步步 骤骤该大实验内容分三部分：该大实验内容分三部分：第一部分第一部分 发酵罐

3、认知发酵罐认知 第二部分第二部分 发酵罐操作演示发酵罐操作演示 第三部分第三部分 利用发酵罐发酵生产链霉素利用发酵罐发酵生产链霉素 第四部分第四部分 发酵液抗菌活性测定发酵液抗菌活性测定 实验步骤 (continued)瑞士比欧公司生产瑞士比欧公司生产L1523型机械搅拌通风发酵罐型机械搅拌通风发酵罐 第一部分第一部分 发酵罐认知发酵罐认知 1、罐体、罐体 2、搅拌装置、搅拌装置 3、加热及冷却装置、加热及冷却装置 4、通气及、通气及排气排气 5、测量装置（温度、搅拌转速、测量装置（温度、搅拌转速、pH、pO2、泡、泡沫）沫） 6、接种、接种 7、取样及排料、取样及排料 8、空气产生、净化、计

4、、空气产生、净化、计量量 9、控制装置、控制装置 实验步骤 (continued)实验步骤 (continued)第二部分第二部分 发酵罐操作演示发酵罐操作演示 （不投料，不接种）（不投料，不接种） L1523发酵罐操作流程发酵罐操作流程 1、发酵前准备工作、发酵前准备工作 1) 把进气过滤器、补料瓶、及可能用到的各种插针在高把进气过滤器、补料瓶、及可能用到的各种插针在高压锅内灭菌。压锅内灭菌。 2) 打开水、电、空压机打开水、电、空压机 3) 打开发酵罐总电源打开发酵罐总电源 4) 校正校正PH电极。之后插入发酵罐内电极。之后插入发酵罐内 5) 将提前配好的培养基放入罐内，并加入消泡剂。将提

5、前配好的培养基放入罐内，并加入消泡剂。 实验步骤 (continued)2、发酵过程、发酵过程 1) 灭菌灭菌 插入所需电极，调整消泡电极高度，关闭罐盖上所用接口插入所需电极，调整消泡电极高度，关闭罐盖上所用接口(确认无确认无任何软管连接任何软管连接)。 启动搅拌，设定转速在启动搅拌，设定转速在300-500 r/min。 设定温度设定温度setp1的值为的值为“0”，使夹套进水。保持约，使夹套进水。保持约2分钟后，再改分钟后，再改回培养温度。回培养温度。 打开排气，装上不锈钢夹套。打开排气，装上不锈钢夹套。 设定灭菌菜单，确认后启动灭菌模式，开始灭菌。设定灭菌菜单，确认后启动灭菌模式，开始灭

6、菌。 具体方法见后具体方法见后实验步骤 (continued)A到到95时，系统出现提示，此时关小排气时，系统出现提示，此时关小排气(关闭后，回旋关闭后，回旋1/3圈圈)，按，按“OK”。B当温度达到当温度达到121时，较正时，较正PO2零点。零点。C降温到降温到100时，系统出现提示。此时，在火焰保护下接好进气插针，时，系统出现提示。此时，在火焰保护下接好进气插针，并通入压缩气体。并通入压缩气体。D到达培养温度后，设定好转速、通气量后。此时校正到达培养温度后，设定好转速、通气量后。此时校正PO2的的100%。 实验步骤 (continued)2）接种）接种 3）补料）补料 4）取样）取样 补

7、料时在火焰保护下插针，需加酸时禁止采用补料时在火焰保护下插针，需加酸时禁止采用HCl (对对不锈钢有腐蚀性不锈钢有腐蚀性) 用取样插针，用罐压压出。插针插入后，打开通气，用取样插针，用罐压压出。插针插入后，打开通气，关闭尾气。关闭尾气。 5) 放料放料 放料前，务必先要关闭温度和转速，确认面板显示放料前，务必先要关闭温度和转速，确认面板显示“OFF” 实验步骤 (continued)3、清洗、清洗 4、关机、关机 在关闭电源前，确认温度和转速处于在关闭电源前，确认温度和转速处于“OFF”状态。电源关闭后，状态。电源关闭后，及时关闭冷却水。发酵罐在不使用的情况下，一般保持一定体积及时关闭冷却水。

8、发酵罐在不使用的情况下，一般保持一定体积的清水。的清水。 第三部分第三部分 利用发酵罐发酵生产链霉素利用发酵罐发酵生产链霉素 （演示发酵过程；分组测定活性）（演示发酵过程；分组测定活性） 实验步骤 (continued)菌种活化菌种活化 斜面菌种制备斜面菌种制备 摇瓶种子制备摇瓶种子制备 L1523L1523型发酵罐中发酵型发酵罐中发酵 实验步骤 (continued)1、菌种活化：、菌种活化： 保存菌种灰色链霉菌（保存菌种灰色链霉菌（Streptomyces griseus）接种于新鲜）接种于新鲜高氏一号培养基平板，取单菌落转接斜面。高氏一号培养基平板，取单菌落转接斜面。（已做）（已做） 实

9、验步骤 (continued)2、斜面菌种制备：、斜面菌种制备： 高氏一号培养基斜面，接种灰色链霉菌，高氏一号培养基斜面，接种灰色链霉菌，28培养培养4天。天。（已备好）（已备好） 实验步骤 (continued)3、摇瓶种子制备、摇瓶种子制备（L-R组）：组）： 向斜面菌种中加入约向斜面菌种中加入约5ml无菌水，用移液器吹打制备孢无菌水，用移液器吹打制备孢子悬液。子悬液。将孢子悬液接入高氏一号液体培养基（将孢子悬液接入高氏一号液体培养基（100ml/500ml100ml/500ml三三角瓶）。角瓶）。2828，200rpm200rpm振荡培养振荡培养4848h h。 4、在、在L1523型发

10、酵罐中发酵型发酵罐中发酵 （演示）（演示） 1) 发酵培养基：发酵培养基：2) 2) 按操作流程进行操作按操作流程进行操作 黄豆饼粉浸液（黄豆饼粉浸液（1%浓度）浓度）1000ml，葡萄糖，葡萄糖10g，NaCl 2.5g，蛋白胨，蛋白胨20g，CaCO3 2g；pH 7.2 3) 3) 发酵条件：发酵条件： 200rpm；1:1通气；通气；28；pH7.2；34d实验步骤 (continued)第四部分第四部分 发酵液抗菌活性测定发酵液抗菌活性测定 （每小组两皿）（每小组两皿） 1、发酵液经、发酵液经5000rpm，10min离心，取上清待测。离心，取上清待测。2、倒底层培养基：向平皿内倒入

11、约、倒底层培养基：向平皿内倒入约15ml牛肉膏蛋白胨固体培养基，平放待牛肉膏蛋白胨固体培养基，平放待凝。凝。3、倒上层培养基：向已融化且冷至、倒上层培养基：向已融化且冷至50的上层培养基试管中加入的上层培养基试管中加入1ml四联四联球菌悬液（师备），摇匀，立即倒入已凝固的底层平板上，平放令其凝固。球菌悬液（师备），摇匀，立即倒入已凝固的底层平板上，平放令其凝固。4、用镊子取一个牛津杯，烧去酒精，垂直放在已凝固的平板上。、用镊子取一个牛津杯，烧去酒精，垂直放在已凝固的平板上。5、吸取、吸取250ul上述上清液，加入牛津杯中；稳端平板放在上述上清液，加入牛津杯中；稳端平板放在37培养箱中培培养箱中

12、培养过夜。养过夜。6 6、观察牛津杯周围有无抑菌圈、测量记录抑菌圈大小、观察牛津杯周围有无抑菌圈、测量记录抑菌圈大小 实验步骤 (continued)实验结果实验结果 实验报告实验报告1 1、实验原理、方法步骤、结果及分析、实验原理、方法步骤、结果及分析 2、思考题、思考题准准 备：备：1、高氏一号液体培养基：、高氏一号液体培养基： （Lab-616） 500ml，分装，分装5瓶，每瓶瓶，每瓶100ml，8层纱布包扎层纱布包扎 配方：配方：可溶性淀粉可溶性淀粉 20g，KNO3 1g，NaCl 0.5g，K2HPO4 0.5g，MgSO4 0.5g，FeSO4 0.01g，水，水1000ml ；pH 7.22、牛肉膏蛋白胨培养基、牛肉膏蛋白胨培养基 （Lab-619Lab-619） 固体培养基（琼脂固体培养基（琼脂1.5%1.5%）：）：400400